一种用于表达抑菌肽的基因、抑菌肽及应用制造技术

本发明专利技术首次从欧洲鳗鲡中发现SEQ ID NO:1的核苷酸序列，并通过基因工程获得具有抑菌活性的抑菌肽，实验证明其能有效地抑制金黄色葡萄球菌的活性，具有抑菌的功能。发明专利技术人通过抑制消减杂交技术，构建了欧鳗感染创伤弧菌前后组织中差异表达基因的抑制性差减杂交文库。从这个文库中我们发现了这个基因出现频率较高，且通过抑菌实验，发现该基因具有抑制致病菌的作用，可作为一种抗生素替代物控制致病菌生长。发明专利技术人将该基因通过基因工程进行表达后，对产物进行纯化去除GST标签等处理后，发现提取物具有溶菌活性。

A gene, antibacterial peptide and its application for expressing antibacterial peptides

This invention first found the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 from Anguilla anguilla and obtained bacteriostatic peptide with bacteriostasis activity through genetic engineering. The experiment proved that it could effectively inhibit the activity of Staphylococcus aureus and have the function of bacteriostasis. The suppression subtractive hybridization library was constructed by suppression subtractive hybridization. From this library, we found that this gene has a high frequency of occurrence, and through bacteriostasis experiments, it is found that the gene has the effect of inhibiting pathogenic bacteria and can be used as an antibiotic substitute to control the growth of pathogenic bacteria. After the gene was expressed by genetic engineering, the product was purified and removed by GST labeling. The results showed that the extract had bactericidal activity.

【技术实现步骤摘要】
一种用于表达抑菌肽的基因、抑菌肽及应用
本专利技术涉及生物工程领域，特别涉及一种用于表达抑菌肽基因、抑菌肽及应用。
技术介绍
细菌性疾病对鳗鲡养殖业威胁较大，常造成巨大的经济损失。通常需要用抗生素对控制病害，但抗生素治疗具有很大的弊端，会发生在鳗鲡体内残留，病原生物耐药性增强，水域生态污染等问题。因此，迫切需要一种适用的抗生素替代物控制致病菌，对细菌性疾病进行防治。
技术实现思路
专利技术人提供了一种分离的多核苷酸，其具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。SEQIDNo.1：atgagaagtgatacacataagatgaagagctctgttggacctctgctgctgctctcccttgttgcttttgtctctgtgacattggccaggagtgtcttcacctttacagatgtccttgccgcggccactgcagacttcaaccagaaaagccaggagacaaaagcttttggacctccaaagatgggcgctttgcggtcaatgtcgatgtttgagcccggagatggctccgtcatgatcaagtccattacgtttacgcttaaggagacagtgtgccccaaatcagaagactacctaaaggaagagtgtgtcttcaaggaaaatgggtctctgaagaagtgctccagtacagctacagtcctgaagtcacagccaggagaggcagcatctctgacagtgtcctgtcaggatgtcacagacccagaggagcgcaagaaactctcagagcctccaagttggacaaaatatttcagcaactgg。进一步地，所述多核苷酸从欧洲鳗鲡中分离。专利技术人还提供了一种抑菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列所编码或是在SEQIDNO:1所示核苷酸序列所编码氨基酸序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。专利技术人还进一步提供了一种质粒，其中含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。+进一步地，所述质粒还包含有表达载体pMD18-T。进一步地，所述质粒还包含有表达载体pGEX-4T-1。专利技术人还提供了的上述抑菌肽，在制备抗菌剂中的用途。专利技术人还提供了一种抑菌组合物，其有效成分包括上述抑菌肽。本专利技术首次从欧洲鳗鲡中发现如SEQIDNO:1的核苷酸序列，并通过基因工程获得具有抑菌活性的抑菌肽，实验证明其能有效地抑制金黄色葡萄球菌的活性，具有抑菌的功能。专利技术人通过抑制消减杂交技术，构建了欧鳗感染创伤弧菌前后组织中差异表达基因的抑制性差减杂交文库。从这个文库中发现了这个基因出现频率较高，且通过抑菌实验，发现该基因具有抑制致病菌的作用，可作为一种抗生素替代物控制致病菌生长。专利技术人将该基因通过基因工程进行表达后，对产物进行纯化去除GST标签等处理后，发现提取物具有溶菌活性。附图说明图1为欧洲鳗鲡elecilin基因的PCR扩增电泳图；其中M：DL2,000TMDNAMarker；1-3：elecilin基因；4：空白对照.图2为质粒pMD18-T-elecilin的双酶切SDS-PAGE图；其中M为DL2,000TMDNAMarker；1-5：重组子酶切结果图3为质粒pGEX-4T-1-elecilin的双酶切SDS-PAGE图；其中，M：DL2,000TMDNAMarker；1-5：重组子酶切结果.图4为elecilin表达产物的SDS-PAGE图；其中：1：BL21/pGEX-4T-1空载未诱导全菌蛋白；2：BL21/pGEX-4T-1空载诱导全菌蛋白；3：BL21/pGEX-4T-1-elecilin未诱导全菌蛋白；4：0D595值为0.2时BL21/pGEX-4T-1-elecilin诱导菌体上清；5：0D595值为0.2时BL21/pGEX-4T-1-elecilin诱导菌体沉淀；6：0D595值为0.4时BL21/pGEX-4T-1-elecilin诱导菌体上清；7：0D595值为0.4时BL21/pGEX-4T-1-elecilin诱导菌体沉淀；M：蛋白质低分子量标准。图5为原核重组融合蛋白GST-elecilin的SDS-PAGE图；其中，1为:上清液；2:流出液；3:洗液；4:洗脱液1；5：洗脱液2；6：洗脱液3；7：洗脱液4；8：洗脱液5。图6为原核重组融合融合蛋白GST-elecilin除标签GST的SDS-PAGE图；其中，1为透析后的GST-CAMP；2为Thrombin酶切16h；3为酶切后挂柱流出液；4为洗脱液1；5为洗脱液2；6为洗脱液3；7为洗脱液4。图7为elecilin蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌试验图；其中,1/8双抗：表示青霉素(12.5U/mL)和链霉素(12.5ng/mL)的混合溶液；挂柱：表示酶切后将GST标签挂在层析柱上后的流出液；E：表示洗脱液数字表示不同的次数(例如E1表示第一次洗脱的洗脱液)；EB：表示洗脱液。具体实施方式为详细说明技术方案的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。实施例1抑菌肽的基因克隆，表达纯化及鉴定1、抑菌肽基因引物的设计与合成：参照Genbank已发表的与差减文库中筛选出的抗菌肽基因片段同源性很高的日本鳗鲡抗菌肽基因序列，采用Primer5和Oligo7两个软件相结合的方法设计和评价抗菌肽基因引物,设计好的引物由上海生工生物有限公司合成。表1设计的欧鳗抗菌肽基因引物2、总RNA的提取及逆转录获得cDNA取实验组欧鳗肝脏、脾脏和肾脏组织分别进行RNA的提取。引取100mg左右的组织于1.5mLEP管中，加入0.2mLTRIzol试剂，先用剪刀将组织剪碎，再用研磨棒在冰上研磨组织，充分研磨后再补充加入0.8mLTRIzol试剂。最后将提取到的RNA用适量无菌0.1％DEPC处理水溶解并冻存于-80℃冰箱中待用。对所获得的RNA样品进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。使用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒对提取的RNA进行逆转录，获取相应的cDNA，具体操作步骤如下：1)冰上构建反应体系：总RNA2μLOligo(dT)(0.5μg/mL)1μLRNasefreeddH2O9μL2)体系组分混合均匀后稍离心，于65℃温浴5min，再冰浴30s，稍离心后再继续加入以下组分：3)混合均匀后稍离心，再于42℃温浴50min后，置于70℃水浴10min，使酶失活，即完成了逆转录实验。最后将获得的cDNA置于-20℃保存。3、elecilin基因克隆及测序(1)以上逆转录所得的cDNA为模板，设计的elecilin-F/elecilin-R为引物进行基因扩增，PCR扩增反应体系(33个循环)及程序如下：通过2％琼脂糖EB胶电泳检测PCR结果,结果如图1欧洲鳗鲡elecilin基因的PCR扩增电泳图所示。由图1可初步判断目的基因得到了很好扩增。(2)用试剂盒对PCR产物进行回收纯化，将回收到的DNA目的片段测序，确定为我们的目的片段后对目的片段进行克隆，以获得全长基因序列。(3)目的基因片段克隆到pMD18-T载体上，将其命引为pMD18-T-elecilin，再转化至大肠杆菌感受态细胞，涂蓝白斑本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的多核苷酸，其具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种分离的多核苷酸，其具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸从欧洲鳗鲡中分离。3.一种抑菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列所编码或是在SEQIDNO:1所示核苷酸序列所编码氨基酸序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。4.一种质粒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈叙，林晨韬，张丽娟，李素一，柯翎，陈华，吴唯维，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35