一种大规模制备重组人成纤维细胞生长因子21（FGF21）的生产方法技术

本发明专利技术提供了人FGF21基因、人FGF21表达载体、人FGF21工程菌以及表达人FGF21的方法，适用于大规模生产。

A method for large-scale preparation of recombinant human fibroblast growth factor 21 (FGF21)

The invention provides a human FGF21 gene, a human FGF21 expression vector, a human FGF21 engineering bacterium, and a method for expressing human FGF21, which is suitable for large-scale production.

【技术实现步骤摘要】
一种大规模制备重组人成纤维细胞生长因子21(FGF21)的生产方法
本专利技术属于蛋白质或多肽制备
，具体而言，本专利技术涉及FGF21的表达的方法及其优化的基因。技术背景成纤维细胞生长因子-21(FGF21)是成纤维细胞生长因子家族的一员，与FGF19和FGF23同属于一个亚家族，分子量为19.5KDa，由181个氨基酸组成，且与鼠源FGF21有75％同源性。FGF21是细胞代谢的一种调节因子，在体内和体外展现多种有利的影响，比如抑制肝葡萄糖生成，刺激脂肪组织葡萄糖摄取，增加褐色脂肪组织产热，保护胰岛质量和胰岛素水平且无促有丝分裂效应或其他副作用。FGF21可作为胰岛素和GLP1类似物的替代物，是治疗II型糖尿病药物中极具前景的一种。天然人FGF-21蛋白在液体发酵条件下非常容易降解，大规模表达FGF21的技术难题限制了其应用。尤其是已有的临床数据报道，FGF-21临床拟用剂量高达3～20mg/人次，因此，FGF-21的发酵低产量直接决定产品的生产成本和临床价格高。为此，国际前列的美国礼来公司和辉瑞公司对FGF-21天然蛋白进行了结构改造，通过一级结构的改变来避免天然人FGF-21的不足。但是，从礼来公司/LY2405319和辉瑞公/PF-05231023临床降糖效果分析，FGF-21改构体可能存在与天然FGF-21人体内降糖作用的差异。本专利技术人没有在现有技术的困难面前退缩，经过艰苦努力，从大量研究中专利技术了一种FGF21的表达的方法，通过优化的基因序列和各种规模的表达方法，能够高产天然人FGF-21。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的人FGF21的表达方法，适合大规模生产。另外，本专利技术还涉及人FGF21基因、人FGF21表达载体、人FGF21工程菌等。在第一方面，本专利技术提供了人FGF21基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。该基因优化了表达，其中并没有完全使用常规的优化密码子。在第二方面，本专利技术提供了包含本专利技术第一方面的人FGF21基因的人FGF21表达载体。优选该人FGF21表达载体是pET-3c质粒，即将人FGF21基因克隆入pET-3c质粒所得的质粒。在第三方面，本专利技术提供了导入了本专利技术第二方面的人FGF21表达载体上的人FGF21工程菌。优选该人FGF21工程菌是大肠杆菌BL21(DE3)，即将人FGF21表达载体上导入大肠杆菌BL21(DE3)所得的菌。在第四方面，本专利技术提供了本专利技术第一方面的人FGF21基因、本专利技术第二方面的人FGF21表达载体或本专利技术第三方面的人FGF21工程菌在表达人FGF21中的应用。优选该表达是大规模(不小于30L，优选大于100L)发酵表达。在第五方面，本专利技术提供了表达人FGF21的方法，其包括：(1)接种本专利技术第三方面的人FGF21工程菌；(2)在不加IPTG的情况下培养；和(3)加入IPTG培养。优选在本专利技术第五方面的步骤(1)中，接种至的培养基包含胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化铵和葡萄糖。优选该培养基的含量(以g/L计)为胰蛋白胨17.0、酵母粉23.0、氯化钠4.0、磷酸二氢钾1.0、磷酸氢二钾3.0、氯化铵4.0和葡萄糖5.0。优选在本专利技术第五方面的步骤(2)的培养中，(通过流加补料)控制pH在6.8～7.0之间并(通过转数、通气量)控制DO值≥30％，于36.8～37.2℃培养至A600达到15～17时终止步骤(2)。优选在本专利技术第五方面的步骤(3)的培养中，待A600达到15～17开始培养，流加IPTG，(通过流加补料)控制pH在7.0～7.2之间，(通过转数、通气量)控制DO值≥30％，于36.8～37.2℃诱导培养。更优选其中，补料溶液包括：碳源，优选为葡萄糖；氮源，优选为胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁；无机盐，优选为硫酸镁和氯化钙；生长因子，优选为维生素B1；和碱，优选为氨水。优选在本专利技术第五方面的方法为发酵罐发酵表达的方法，其中发酵罐不小于30L，优选大于100L。本专利技术具有以下有益效果：高产FGF21，适合大规模生产，可以降低生产成本和临床价格等。为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本专利技术进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本专利技术范围的限制。依据本说明书的论述，本专利技术的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本专利技术引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本专利技术，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。附图说明图1显示了rhFGF-21工程菌的生长曲线。图2显示了不同诱导时间对菌体密度(A600)的曲线。图3显示了rhFGF-21工程菌诱导1～6h电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～8：分别为诱导后1～6h。图4显示了不同诱导剂浓度对菌体密度(A600)曲线。图5显示了不同IPTG浓度对rhFGF-21表达电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～9：IPTG浓度分别为0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L。图6显示了诱导时机对rhFGF-21工程菌影响曲线。图7显示了诱导时机对目的蛋白表达电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～8：分别在A600为0.2、0.4、0.8、1.2、1.8、2.5诱导。图8显示了不同培养温度对菌体密度(A600)曲线。图9显示了不同诱导温度对菌体密度(A600)曲线。图10显示了最适诱导温度的选择，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marke；3～6：分别33℃、35℃、37℃、39℃诱导4h。图11显示了不同初始培养pH值对菌体密度(A600)曲线。图12显示了不同诱导pH值对菌体密度(A600)曲线。图13显示了不同pH下目的蛋白表达电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～7：pH分别为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4。图14显示了不同培养基装量对菌体密度(A600)曲线。图15显示了不同培养基装量对菌体密度(A600)曲线。图16显示了不同培养基装量下目的蛋白表达电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～6：装液量分别为25、50、75、100mL。图17显示了不同葡萄糖浓度对菌体密度(A600)曲线。图18显示了不同葡萄糖浓度对菌体密度(A600)曲线。图19显示了不同葡萄糖浓度对目的蛋白表达电泳图1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～8：葡萄糖终浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、20g/L。图20显示了不同氯化铵浓度对菌体密度(A600)曲线。图21显示了不同氯化铵浓度对菌体密度(A600)曲线。图22显示了不同氯化铵浓度对目的蛋白表达电泳图，其中，泳道1：诱前；2：低分子量蛋白Marker；3～7：氯化铵终浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、8g/L。图23显示了rhFGF-21工程菌罐发酵生长曲线。具体实施方式实施例1工程菌的构建根据GenBa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人FGF21基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.人FGF21基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.包含权利要求1所述的人FGF21基因的人FGF21表达载体(优选是pET-3c质粒)。3.导入了权利要求2所述的人FGF21表达载体上的人FGF21工程菌(优选是大肠杆菌BL21(DE3)。4.权利要求1所述的人FGF21基因、权利要求2所述的人FGF21表达载体或权利要求3所述的人FGF21工程菌在表达人FGF21中的应用。5.表达人FGF21的方法，其包括：(1)接种权利要求3所述的人FGF21工程菌；(2)在不加IPTG的情况下培养；和(3)加入IPTG培养。6.权利要求5所述的方法，其中步骤(1)中，接种至的培养基包含胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化铵和葡萄糖，优选含量g/L为胰蛋白胨17.0、酵母粉23.0、氯化钠4.0、磷酸二氢钾1.0、磷酸氢二钾3.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓杰，李校堃，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33