一种用于敲除CCR5基因的gRNA、表达载体、敲除系统、试剂盒技术方案

本发明专利技术公开了一种用于敲除CCR5基因的gRNA、基因敲除系统及试剂盒，所述基因敲除系统通过Nickase蛋白结合一对RNA嵌合体来进行，联合使用一对RNA嵌合体分别结合于靶基因的正义链和反义链，通过Nickase的作用分别在两条链上产生一个缺口，形成带粘性末端的双链断裂，然后细胞通过NHEJ机制将双链修复并引入突变，即可实现基因敲除，并且双RNA嵌合体的使用让gRNA和靶序列的识别位点从20nt扩大到40nt，大大地减少了潜在的脱靶可能性。此外，本发明专利技术还公开了所述gRNA在制备用于预防或治疗HIV感染的药物中的用途，实现了敲除细胞表面的HIV病毒辅助受体CCR5，在有效进行CCR5基因敲除的前提下，大大减少脱靶效率，提高临床使用的可行性，降低安全风险。

GRNA, expression vector, knockout system and kit for knockout CCR5 gene

The invention discloses a gRNA, gene knockout system and kit for knocking out the CCR5 gene. The knockout system is carried out by combining a pair of RNA chimeras through the Nickase protein, combined with a pair of RNA chimeras in the just chain and antisense chain of the target gene, respectively, by the effect of Nickase on two chains. A gap is made to form double strand breaks with sticky ends, and then cells repair and introduce mutations through NHEJ mechanism to knock out genes, and the use of double RNA chimeras enlarges the identification sites of gRNA and target sequences from 20nt to 40nt, greatly reducing the potential for potential miss. In addition, the invention also discloses the use of the gRNA in preparing drugs for preventing or treating HIV infection, realizing the HIV virus auxiliary receptor CCR5 that knocks off the surface of the cell, greatly reducing the loss of target efficiency, improving the feasibility of clinical use and reducing the safety risk on the premise of effective CCR5 gene knockout.

【技术实现步骤摘要】
一种用于敲除CCR5基因的gRNA、表达载体、敲除系统、试剂盒
本专利技术涉及用于敲除CCR5基因的gRNA、表达载体、基因编辑系统、试剂盒及它们的相关用途，属于基因工程领域。
技术介绍
获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)感染所引起的免疫系统疾病，是一种危害性极大的全球化传染病。HIV以人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击对象，造成免疫功能丧失，从而易患各种疾病，死亡率高达99％-100％。HIV在人体内的潜伏期能长达8-10年，很多HIV感染者在发展成艾滋病患者之前可以无病症的生活，但病毒在人体内始终存在并不可治愈。虽然全世界众多医学研究人员专注于艾滋病的预防和治疗，但至今尚未研制出特效药物，由于HIV的变异极其迅速，因此也还没有可用于预防的有效疫苗。对于HIV感染的治疗，目前的主要策略是最大限度和持久的降低病毒载量、获得免疫功能重建和维持免疫功能、提高生活质量，以及降低HIV相关的发病率和死亡率。抗逆转录病毒治疗(anti-retroviraltherapy，ART)是近年来广泛使用的治疗手段，它有效抑制HIV在体内的复制，减少体内病毒载量，从而延长感染者的寿命。但药物副作用、病毒的耐药性突变、终身服药的依从性等都是抗逆转录病毒治疗在临床使用上不可避免的问题。而以基因为基础的治疗方法可以持续的抑制病毒从而减少治疗干预措施，是一种非常有前景的治疗方式。随着基因编辑技术的兴起，多国科学家都尝试通过ZFN、TALENT、CRISPR-cas9等基因编辑技术，敲除HIV入侵和整合过程中的关键基因，从而干预病毒的转录、复制和扩散。全球首例HIV感染的治愈发生在“柏林病人”身上，他接受了一名CCR5-Δ32基因突变纯合体捐献者的骨髓移植，此后的五年都没有在其身上检测到HIV病毒的踪迹。HIV-1主要有R5-嗜性和X4-嗜性两种，对应的辅助受体分别为CCR5和CXCR4，R5-嗜性病毒是目前最普遍感染且在感染的前期起主导作用的病毒类型。通过基因编辑的方式敲除或抑制细胞(如CD4+T细胞、淋巴细胞、骨髓干细胞等)表面的HIV病毒辅助受体CCR5的表达，抑制病毒扩散从而延缓和治疗艾滋病，已经成为HIV基因治疗研究的常见思路。对HIV感染基因治疗手段的发展经历了两个阶段：一，基于RNA的治疗方法，即一种下调相关基因表达量的方法，如shRNA、siRNA、反义RNA等；二，基于蛋白质的治疗方法，即对相关基因的敲除，如ZFN(ZincFingerNuclease)、CRIAPR/Cas9，TALEN(TranscriptionActivator-likeEffectorNuclease)等。其中CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)-Cas(CRISPR-associatedendonuclease)系统是基因治疗领域的新成员，是一款强大的基因编辑工具。有别于ZFN和TALEN需要研究者根据目的基因设计和生产一对特异性的核酸酶，CRISPR更简单，具有更广泛的适应性适应前景更广泛。CRISPR是在细菌体内发现的一种抵抗外来病毒入侵的系统，科学家在多种细菌中均发现了CRISPR，但目前最常用，研究最成熟的是酿脓链球菌Streptococcuspyogenes的CRISPR系统。它由一段crRNA和tracrRNA的嵌合体(crRNA-tracrRNAchimera)和一个Ⅱ类CRISPR系统的非特异性的内切核酸酶9(Cas9)组成，其中的RNA嵌合体由一段Cas9绑定序列gRNAscaffold和一段20nt左右的靶向结合目的基因/位点的RNA向导序列(guideRNA，gRNA)构成。靶序列末端的PAM(5’-NGG-3’)序列(protospaceradjacentmotif)为Cas9识别位点,是实现剪切功能的关键。只要根据目的基因设计特异性的gRNA序列，即可引导Cas9在靶位点附近进行切割，产生双链断裂(doublestrandbreak,DSB)，然后细胞通过容易产生插入/缺失突变的非同源末端连接(non-homologousend-joining，NHEJ)将其修复，从而破坏目的基因的开放阅读框，达到敲除基因的目的。因为酿脓链球菌Cas9的PAM序列只有三个核苷酸，gRNA识别的靶序列也只是20个核苷酸，虽然设计和使用起来简便，但是非特异结合(脱靶)的几率也相对较大。脱靶即RNA嵌合体和Cas9蛋白非特异的结合于除目的基因以外的基因组的其他位点，可能导致非预期的基因突变，对人体造成不可预估和不可控制的影响。脱靶效率对于基因治疗来说，是临床使用上的安全隐患，也是限制该技术发展和应用的主要原因。Nickase(缺口酶)是Cas9蛋白的D10A突变型，它保留了结合gRNA从而靶定目的基因的功能，但是不能产生双链断裂，只能在识别位点附近产生一个单链缺口。切口酶配合一对gRNA(分别位于正义链和反义链)使用，可分别在相对的两条DNA链上产生切口，从而形成功能性的双链断裂。随后细胞通过NHEJ机制修复基因并引入插入/缺失突变，达到基因敲除的目的。Nickase配合一对分别位于目的基因正义链和反义链的gRNA使用，将特异性识别的靶序列从一段20nt的核苷酸序列扩增到两段共40nt的核苷酸序列，同时两段靶序列的3’-端都要求有PAM序列。这种设计最大限度的降低了CRISPR技术的脱靶效应，大大减少了非预期的脱靶基因修饰。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能有效敲除CCR5基因的CRISPR-Cas9基因编辑系统，在有效敲除CCR5基因的同时使得设计和使用大大简化。另外，本专利技术还提供一种既能有效敲除CCR5基因，又能将脱靶效率降到最低的CRISPR-nickase基因编辑系统，从而降低CRISPR技术在HIV基因治疗中使用的安全风险，提高临床应用的可行性。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：本专利技术通过使用CRISPR-Cas9技术来编辑、敲除CCR5基因，只要在PAM序列(5’-NGG-3’)的5’-端根据CCR5的核苷酸序列设计20nt的特异性gRNA序列，即可引导Cas9在靶位点附近进行切割，产生双链断裂(doublestrandbreak,DSB)，然后细胞通过容易产生插入/缺失突变的非同源末端连接(non-homologousend-joining，NHEJ)将其修复，从而破坏目的基因的开放阅读框，达到敲除基因的目的。相比起ZFN技术，本方案设计简便，靶位点可选性大，系统构建容易，使用成本低，但是，但正由于CRISPR-Cas9对于目的基因的识别只依赖20nt的核苷酸序列，相较ZFN来说，存在更高的脱靶风险。通过Nickase蛋白(Cas9的D10A突变体)结合一对RNA嵌合体可以大大降低潜在的脱靶风险。Nickase，即缺口酶，它保留了Cas9对RNA嵌合体的识别能力，但只能对靶序列的一条核苷酸链进行切割，使基因组的DNA双链产生一个缺口而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于敲除CCR5基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:114中的一种所示。

【技术特征摘要】
2016.12.13 CN 20161114734931.一种用于敲除CCR5基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA的靶序列如SEQIDNO:1-SEQIDNO:114中的一种所示。2.一种用于敲除CCR5基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体表达如权利要求1所述的gRNA。3.一种用于敲除CCR5基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，包括如权利要求1所述的gRNA和cas9蛋白。4.一种用于敲除CCR5基因的试剂盒，其特征在于，包括表达cas9蛋白和如权利要求1所述的gRNA的载体。5.一种用于敲除CCR5基因的gRNA组合物，其特征在于，所述gRNA组合物由靶序列如SEQIDNO:29所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:98所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:35所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:98所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:36所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:98所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:37所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:98所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:36所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:99所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:53所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:104所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:45所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:104所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:48所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:104所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:49所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:104所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:46所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:108所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:46所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:109所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:46所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:110所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:46所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:104所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:53所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:109所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:53所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:110所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:53所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:113所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:54所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:109所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:54所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:110所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:54所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:113所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:55所示的gRNA和靶序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶米林，罗思施，祝海宝，梁福才，黄雨亭，唐忆琳，刘方方，
申请(专利权)人：广东赤萌医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44