检测肺炎标志物活性的双光子荧光探针及合成方法技术

本发明专利技术公开了检测肺炎标志物活性的双光子荧光探针及合成方法。其荧光探针的结构式为：

Two photon fluorescence probe for detection of pneumonia marker activity and its synthetic method

The invention discloses a two-photon fluorescent probe for detecting the activity of pneumonia markers and a synthetic method thereof. The structure of the fluorescent probe is as follows:

【技术实现步骤摘要】
检测肺炎标志物活性的双光子荧光探针及合成方法
本专利技术涉及检测肺炎标志物活性的双光子荧光探针及合成方法，尤其是检测肺炎标志物LTA4H蛋白酶上活性的双光子荧光探针及合成方法。
技术介绍
肺炎是一种由致病菌引起的肺泡及呼吸性支气管方面的疾病，会导致病人产生局部的及系统性的发炎反应。而且，肺炎会导致多种并发症的发生，比如脑膜炎、败血症、肺脓肿、脑损伤及听力受损等疾病，因此肺炎的发病率及致死率居高不下。在临床上，确诊肺炎需要多种技术方法和临床指标，包括胸透及CT成像扫描，血液及咳出痰等样品的细菌培养，以及某些临床特征。其中，胸透及CT成像扫描是用来诊断肺炎的重要手段，但是并不适用于全部人群，而且可能会导致一定的机体损伤，比如细胞癌变、染色体异常、生殖细胞畸变等。因此，急需发展出一种无损伤、快速、原位准确的肺炎成像检测技术与筛选肺炎抑制剂或肺炎药物的方法。结合使用高灵敏、高特异性荧光探针的双光子荧光成像技术，是从分子水平上研究细胞及活体生物学事件与疾病发生发展的一种无损、非侵入性的重要的成像方法。由于双光子成像所用的激发波长位于近红外区域(690～950nm)，所以具有更深的组织穿透深度，较高的时空分辨率，以及较小的光毒性等优势。因此，使用特异性响应肺炎标志物分子的荧光探针，通过双光子荧光成像诊断肺炎与筛选肺炎抑制剂将会是一种有效的手段。LTA4H(LeukotrieneA4hydrolase)是一种具有双重活性的酶，已有文献报道LTA4H是一种参与宿主防御过程中多肽降解的蛋白质，该蛋白在肺炎等炎症过程中表达含量升高，与炎症的发生发展密切相关。现在对于检测LTA4H与筛选其抑制剂的探针是极其缺乏的，应用于细胞及活体内检测LTA4H的探针更是少之又少。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的之一是提供一种检测肺炎标志物活性的双光子荧光探针，其对肺炎标志物LTA4H的检测表现出高灵敏、高选择性。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种检测肺炎标志物活性的双光子荧光探针，其结构式为：命名为斯托克斯位移荧光探针(ASPC)。当LTA4H蛋白的活性中心识别该双光子荧光探针中相应的底物部分后，会切断酰胺键从而使探针荧光明显的增强。将其应用于活细胞及小鼠肺炎模型的研究中，都呈现出了良好的检测效果。本专利技术的目的之二是提供一种上述双光子荧光探针的合成方法，包括原料a和原料c，先将原料a中羧基进行酰卤化反应获得中间体b，再将中间体b的酰卤基团与原料c的氨基进行亲核取代反应并脱除叔丁氧羰基，即可获得双光子荧光探针；原料a的化学结构为原料c的化学结构为其中，Boc为叔丁氧羰基，X为卤素。本专利技术的目的之三是提供一种上述双光子荧光探针在检测LTA4H蛋白的活性中的应用。所述检测LTA4H蛋白的活性为非治疗与检测疾病为目的。本专利技术的有益效果为：1.本专利技术的探针分子具有双光子激发(690nm)性质，具有较大的斯托克斯位移(80nm),有效地较低了自吸收，提高了成像准确度。2.基于酶的底物专一性与光致电子转移原理，设计合成出特异性检测LTA4H活性的荧光探针ASPC，该探针在与LTA4H反应后可以发出强烈绿色荧光，能够指示LTA4H的氨肽酶活性，而且ASPC对LTA4H具有极高的选择性，不会被其他的氨肽酶切断，今后有望作为筛选抗炎药物的检测平台。3.本专利技术的探针分子具有较低的细胞毒性，对细胞及活体的损伤小。4.本专利技术的探针分子能够同时实现单双光子共聚焦对细胞的成像染色。5.本专利技术的探针分子对肺炎小鼠可以实现原位检测肺炎，且检测结果与肺炎因子试剂盒检测的结果一致，说明ASPC能够实现对活体的LTA4H的检测，具有极其重要的意义。6.本专利技术的探针分子合成步骤相对简单、产率较高、容易纯化。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。图1是本专利技术荧光探针反应前后的吸收、单光子发射与双光子发射的荧光谱图，其中，横坐标为波长(nm)，左侧纵坐标为紫外吸收强度，右侧纵坐标为荧光发射强度，●为ASPC加入LTA4H之前的单光子吸收光谱，○为ASPC加入LTA4H之前的单光子发射光谱，▲为ASPC加入LTA4H之后的吸收光谱，△为ASPC加入LTA4H之后的单光子发射光谱；图2是本专利技术荧光探针与细胞内相关氨基酸、氨肽酶、小分子等成分的选择性测定柱状图与荧光谱图；图3是本专利技术荧光探针在人星形肝细胞LX-2的单双光子共聚焦荧光成像图；图4是本专利技术荧光探针在肺炎小鼠肺部不同深度的双光子共聚焦荧光成像图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。正如
技术介绍
所介绍的，现有技术中存在对于检测LTA4H与筛选其抑制剂的探针极其缺乏的不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出了检测肺炎标志物活性的双光子荧光探针及合成方法。本申请的一种典型实施方式，提供了一种检测肺炎标志物活性的双光子荧光探针，其结构式为：命名为斯托克斯位移荧光探针(ASPC)。当LTA4H蛋白的活性中心识别该双光子荧光探针中相应的底物部分后，会切断酰胺键从而使探针荧光明显的增强。将其应用于活细胞及小鼠肺炎模型的研究中，都呈现出了良好的检测效果。本申请的另一种实施方式，提供了一种上述双光子荧光探针的合成方法，包括原料a和原料c，先将原料a中羧基进行酰卤化反应获得中间体b，再将中间体b的酰卤基团与原料c的氨基进行亲核取代反应并脱除叔丁氧羰基，即可获得双光子荧光探针；原料a的化学结构为原料c的化学结构为其合成路线如下：其中，Boc为叔丁氧羰基，X为卤素。优选的，其步骤为：(1)将原料a溶于溶剂中，加入酰卤化试剂，进行酰卤化反应后获得中间体b；(2)将中间体b与原料c溶于乙酸中加热回流反应后即可获得双光子荧光探针。所述酰卤化试剂为能够与羧基反应生成酰卤基团的化合物，例如二氯亚砜、三氯氧磷、五氯化磷、草酰氯、光气、双光气、三光气或相应的溴代、碘代化合物等。为了提高原料a的与酰卤化试剂的，由于原料a在二氯甲烷中的溶解度更高，因而进一步优选的，所述溶剂为二氯甲烷。为了进一步简化反应步骤，所述酰卤化试剂为二氯亚砜。更进一步优选的，酰卤化反应的条件为室温反应2～3h。本申请所述的室温是指温度为20～25℃。为了获得纯度更高的中间体b，增加荧光探针的反应效率，进一步优选的，酰卤化反应后去除溶剂后进行重结晶即可。更进一步优选的，重结晶的溶剂为石油醚与二氯甲烷体积比为5:1的混合溶液。进一步优选的，原料c与中间体b的摩尔比为1:1～1.2。进一步优选的，步骤(2)中加热回流反应的条件为：温度90±5℃，反应时间为5±0.5h。为了提高荧光探针的纯度，进一步优选的，加热回流反应后取出溶剂，进行硅本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肺炎标志物活性的双光子荧光探针，其特征是，其结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种检测肺炎标志物活性的双光子荧光探针，其特征是，其结构式为：2.一种权利要求1所述的双光子荧光探针的合成方法，其特征是，包括原料a和原料c，先将原料a中羧基进行酰卤化反应获得中间体b，再将中间体b的酰卤基团与原料c的氨基进行亲核取代反应并脱除叔丁氧羰基，即可获得双光子荧光探针；原料a的化学结构为原料c的化学结构为3.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，其步骤为：(1)将原料a溶于溶剂中，加入酰卤化试剂，进行酰卤化反应后获得中间体b；(2)将中间体b与原料c溶于乙酸中加热回流反应后即可获得双光子荧光探针。4.如权利要求3所述的合成方法，其特征是，所述溶剂为二氯甲烷。5.如权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐波，王慧，薛珂，仇裕鹤，姜雪雪，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37