一种取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种取代吲哚‑2‑羧酸类Bcl‑2小分子荧光探针及其应用。该荧光探针的结构通式如式如下所示：

A Bcl-2 small molecule fluorescent probe instead of indole -2- carboxylic acid and its application

The invention discloses a small molecule fluorescent probe for replacing Bcl 2 2 carboxylic acid of indole and its application. The general structure of the fluorescent probe is as follows:

【技术实现步骤摘要】
一种取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针及其应用
本专利技术涉及取代吲哚-2-羧酸衍生物及其作为Bcl-2小分子荧光探针，与其在Bcl-2抑制剂活性筛选、细胞毒性评价及细胞成像中的应用，属于药物

技术介绍
B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cellleukemia/lymphoma-2,Bcl-2)蛋白家族是细胞凋亡内源性途径中重要的调控因子，在细胞凋亡通路中起着重要的调节作用。根据结构与功能不同，Bcl-2蛋白家族可分为抗凋亡家族蛋白和促凋亡家族蛋白。在正常的细胞中，促凋亡家族蛋白和抗凋亡家族蛋白异二聚体化，使细胞保持正常生长状态，既避免细胞过早凋亡又避免细胞因不发生凋亡而转化为肿瘤细胞。但在一些恶性肿瘤中，Bcl-2蛋白家族的抗凋亡蛋白成员过度表达，导致一般的化疗手段无法使肿瘤细胞发生凋亡，从而影响肿瘤的治疗效果，产生耐药性。因此，针对Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员的抑制剂研究已经成为近年来抗肿瘤药物的研究热点。目前在哺乳动物体内已经发现超过25个Bcl-2蛋白家族成员，这些成员根据结构与功能不同可分为两个亚族：抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白成员包括Bcl-2，Bcl-xl，Mcl-1，Al，Bcl-w，Bcl-RAMBO和Boo。该亚族成员能够抑制细胞凋亡,大部分(除了Mcl-1和A1)都含有四个Bcl-2同源区(Bcl-2homology,BH)BH1-BH4。促凋亡蛋白又可分为两个亚家族：含有2-3个保守区域的多区域促凋亡蛋白亚家族(Bak、Bax等)和只含有一个保守BH3区域的BH3-only蛋白(Bad、Bik、Bid、Bim、Hrk、Bmf、Puma、Noxa等)。Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡线粒体途径中关键调节因子，通过调节线粒体膜通透性调控细胞凋亡。正常情况下，Bax和Bak与Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员(如Bcl-2、Mcl-1等)相互结合以非活性的单体形式存在。非活性的Bax主要分布于细胞质中，而Bak则主要镶嵌在线粒体外膜上。当细胞接受凋亡信号之后，一些BH3-only蛋白(如Bad、Noxa等)竞争性与Bcl-2抗凋亡成员的疏水结合域相结合，释放出被抑制的Bax和Bak蛋白。此后，另一些BH3-only蛋白(如Bim、Puma等)可直接与Bax和Bak蛋白相互作用使其活化。活化的Bax和Bak蛋白在线粒体外膜上发生寡聚化，使细胞通透性孔打开，膜通透性增大而释放细胞色素c等细胞凋亡因子，诱导细胞凋亡。因此，抑制肿瘤细胞的Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员可促进肿瘤细胞的凋亡。目前，约有五类Bcl-2抑制剂，其中大部分已处于临床研究例如Gossypol处于I/II期临床等，但是经过临床研究发现，由于细胞凋亡途径的多样性，部分抑制剂仍无法使肿瘤细胞发生凋亡，从而影响肿瘤的治疗效果，产生耐药性，从而导致该类药物的临床应用受到很大限制。小分子荧光探针具有快速、灵敏、高通量和易于自动化等特点在蛋白标记与成像技术中有着重要的作用，目前小分子荧光探针已经广泛应用于蛋白质、核酸等重要生物分子的生物学和药理学检测中，对疾病机制探讨、临床诊断及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。但是能够专一地与目标蛋白结合的小分子探针较少，设计和合成方法的缺乏是主要因素，目前还没有用于研究Bcl-2家族蛋白间相互作用的小分子荧光探针。鉴于此，为了更深入了解Bcl-2蛋白间的作用机制及发现更有效的抑制剂，亟待研发一种可以特异性结合Bcl-2蛋白的小分子探针。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针及其制备方法、光学活性、生物活性和在制药领域中的应用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针，具有下述结构通式：通式I中，R1为各类荧光团；R2为卤素；通式II，R3为各类荧光团；R4为卤素。优选地，所述R1为萘磺酰胺类和AIE类荧光团；R2为氯；R3为萘磺酰胺类荧光团；R4为氯；更优选地，本专利技术的取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针选自如下结构式的化合物：该取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针L1的制备方法，其反应过程如下：优选的，具体步骤为：(1)4-氯苯胺在盐酸与亚硝酸钠条件下生成重氮盐，重氮盐再与2-环戊酮甲酸乙酯生成中间体2，(2)中间体2经过成酯反应得到中间体3，(3)中间体3再经环合反应得到产物4，(4)产物4经脱保护反应得到中间体5。(5)化合物6在氨气条件下得化合物7，(6)关键中间体5与7酰胺缩合再经脱乙酯反应，则可得终产物L1。进一步优选的，所述步骤(1)的具体步骤为：盐酸被加入圆底烧瓶中，加入水，之后，在冰浴条件下，3-氯苯胺被加入到反应瓶中，5分钟后亚硝酸的水溶液被逐渐加入。2-环戊酮甲酸乙酯被溶于EtOH中，然后和KOH溶液被逐渐滴入，半小时后，3-氯苯胺的反应液逐渐被加入到后者反应液中，混合反应液于40℃油浴中反应1h。反应液被浓缩得到粗产品2，未经纯化直接进行下一步反应。所述的盐酸、水：3-氯苯胺、亚硝酸、2-环戊酮甲酸乙酯、EtOH及氢氧化钾的使用比为(7m，1M)L：9mL：(1.27g，10mmol)：(1.38g，20mmol)：(2.5mL，15mmol)：(5.0g，90mmol)。进一步优选的，所述步骤(2)的具体步骤为：化合物2溶于乙醇溶液中浓硫酸被逐渐加入。混合反应液回流反应2h，后反应液恢复至室温，蒸除乙醇溶剂用乙酸乙酯进行萃取，干燥浓缩后经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)得到纯产物3。所述的化合物2、乙醇及浓硫酸的使用比为(3.3g，10mmol)：25mL：3mL。所述的产物3为浅黄色固体，产率为40％，mp：81-83℃。1H-NMR(400MHz,CDCl3),δ9.86(s,1H),7.40-7.39(m,1H),7.28(s,1H),7.23-7.22(m,1H),6.94-6.91(m,1H),4.36-4.27(m,4H),2.65-2.61(m,2H),2.50-2.47(m,2H),1.80-1.74(m,2H),1.43(t,J＝8.0Hz,3H),1.37(t,J＝8.0Hz,3H)。进一步优选的，所述步骤(3)的具体步骤为：中间体3溶于甲苯中，对甲苯磺酸被加入反应液回流12h。冷却反应液后旋除溶剂用乙酸乙酯萃取，干燥旋干后得的油经重结晶(正己烷)得到纯的化合物4。所述的中间体3、甲苯、甲苯磺酸的使用比为(0.68g，2mmol)：10mL：(0.58g，3mmol)。所述的产物4为浅黄色固体，白色固体，产率为83％，mp：93-95℃。1H-NMR(400MHz,CDCl3),δ9.91(d,J＝12.0Hz,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(s,1H),7.15-7.12(m,1H),4.46-4.42(m,2H),4.19-4.09(m,2H),3.76-3.72(m,1H),3.42(t,J＝8.0Hz,1H),2.74-2.67(m,2H),1.47-1.44(m,3H),1.30(t,J＝8.0Hz,1H),1.24(t,J＝8.0Hz,2H)。进一步优选的，所述步骤(4)的具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种取代吲哚‑2‑羧酸类Bcl‑2小分子荧光探针，探针结构通式如下所示：

【技术特征摘要】
1.一种取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针，探针结构通式如下所示：通式I中，R1为各类荧光团，R2为卤素；通式II，R3为各类荧光团，R4为卤素。2.如权利要求1所述的取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针，其特征在于，所述R1为萘磺酰胺类和AIE类荧光团，R2为氯，R3为萘磺酰胺类荧光团，R4为氯。3.如权利要求1或2所述的取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针，其特征在于，该类小分子探针选自具有如...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敏勇，杜吕佩，刘婷婷，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37