用于DNA片段的非特异性复制的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种用于DNA片段的非特异性复制的方法及试剂盒。总体而言，本发明专利技术公开的方法通过对希望进行复制的DNA片段进行加接头，得到加接头的DNA片段，利用引物对加接头的DNA片段进行PCR扩增，再对PCR产物进行切割，最后获得大量与希望进行复制的DNA片段基本相同的可利用DNA片段。

Method and kit for non-specific replication of DNA fragments

The invention relates to a method and a kit for non-specific replication of DNA fragments. In general, the open method of the invention is used to add the DNA fragment of the desired replica, to obtain the DNA fragment of the added joint, to amplify the DNA fragment of the added joint by using primers, and then to cut the PCR products, and finally obtain a large number of DNA fragments that are basically the same as those of the DNA fragments that want to be replicated.

【技术实现步骤摘要】
用于DNA片段的非特异性复制的方法及试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于DNA片段的非特异性复制的方法及试剂盒。
技术介绍
DNA扩增的方法有很多，常规的扩增方法主要有两种。一是利用随机引物与DNA的任意位置相结合并扩增，从而获得大量的随机长度的DNA片段。二是将DNA分子加人工接头连接，然后以加接头的DNA片段为模板进行DNA扩增。前种方法的缺点是，扩增产物DNA分子长度小于原来的DNA分子，DNA分子的完整性遭到破坏，不能将模板分子的全长扩增，小片段产物过多，导致用于常规检测的有效DNA模板量不足。对于由小片段DNA分子构成的样本如游离DNA样本，此方法将难以获得扩增产物。第二种方法虽然能够较为完整的获得微量DNA分子的复制扩增产物，但是产物分子两端引入了较长的人工序列，改变了原始DNA分子的序列信息，对于基于DNA序列信息的检测及研究极易造成非特异性的干扰或信息的丢失，尤其是对于NGS等第二代测序类检测手段，原始DNA分子本身带有部分外源DNA序列信息将造成极大的干扰。
技术实现思路
鉴于上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种DNA片段的非特异性复制的方法及试剂盒，通过对希望进行复制的DNA片段的非特异性扩增，得到大量与希望进行复制的DNA片段基本相同的可利用DNA片段。本专利技术为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：使用引物对加接头的DNA片段进行PCR扩增，利用酶切试剂对PCR扩增产物进行切割，获得大量与希望进行复制的DNA片段基本相同的可利用DNA片段。即，本专利技术包括：1.一种DNA片段的非特异性复制的方法，包括：步骤B：将经过处理的希望进行复制的DNA片段加接头，得到加接头的DNA片段；步骤C：使用与所述接头的核苷酸序列相结合的引物对所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤D：采用切割的试剂将PCR产物进行切割，得到大量与希望进行复制的DNA片段基本相同的可利用DNA片段。2.根据项1所述的方法，其中，所述接头为具有切割信息的接头。3.根据项2所述的方法，其中，所述切割信息位于所述接头的靠近用于与所述经过处理的希望进行复制的DNA片段相连接的一端。4.根据项3所述的方法，其中，所述切割信息为切割位点。5.根据项4所述的方法，其中，所述切割位点为至少1bp的核苷酸序列。6.根据项4所述的方法，其中，所述切割位点为至少一个酶切位点或含有至少一个T碱基的碱基序列。7.根据项2所述的方法，其中，所述具有切割信息的接头是由核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2经退火反应形成的产物。SEQIDNO：1序列：5'-At(N)a(N)b-3'，SEQIDNO：2序列：5'-(N)c(N)'aT-3'，其中，N选自A、T、C、G四种碱基中的任意一种，(N)a与(N)'a核苷酸序列反向互补，t为0或1，a、b和c分别为5以上的自然数，优选地a为5～30，更优选地a为10～20，优选地b为5～20，更优选地b为10～20，优选地c为10～20。8根据项1所述的方法，其中，所述引物为具有切割信息的引物。9.根据项8所述的方法，其中，所述切割信息位于所述引物的3'端区域。10.根据项8所述的方法，其中，所述切割信息为切割位点。11.根据项10所述的方法，其中，所述切割位点为至少1bp的核苷酸序列。12.根据项10所述的方法，其中，所述切割位点为至少一个酶切位点或含有至少一个T碱基的碱基序列。13.根据项8所述的方法，其中，所述的具有切割信息的引物是如SEQIDNO：3所示核苷酸序列和SEQIDNO：4所示核苷酸序列。SEQIDNO：3序列：5'-(N)e(N)'b(N)'aU(M)k-3'，SEQIDNO：4序列：5'-(N)f(N)c(N)'aU(M)g-3'，其中，N选自A、T、C、G四种碱基中的任意一种，M为随机碱基，(N)a与(N)'a核苷酸序列反向互补，(N)'b与(N)b核苷酸序列反向互补，e、f、g、k为自然数，a、b和c分别为5以上的自然数，优选地a为5～30，更优选地a为10～20，优选地b为5～20，更优选地b为10～20，优选地c为10～20，优选地e为0～20，f为0～20，更优选e为0，f为0，优选地g、k为0～5，更优选地g、k为0～3。14.根据项1所述的方法，其中，所述切割方式为试剂切割。15.根据项14所述的方法，其中，所述试剂切割是采用切割试剂进行至少一次切割。16.根据项15所述的方法，其中，所述切割试剂为至少一种具有切割功能的酶。17.根据项16所述的方法，其中，所述具有切割功能的酶为下组中至少一种：限制性内切酶、外切酶、具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶和具有单链特异性切割功能的酶.18.根据项17所述的方法，其中，所述具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶为UDG或EndonucleaseVIII和UDG的混合物，所述具有单链特异性切割功能的酶选自绿豆核酸酶和/或S1核酸酶。19.根据项1所述的方法，其中，步骤B中所述希望进行复制的DNA片段的量为0.1～100ng。20.根据项1所述的方法，其中，步骤B中所述希望进行复制的DNA片段的大小为80～1000bp，优选地片段大小为100～250bp。21.根据项1所述的方法，其中，包括在步骤B之前进行的步骤A-2：将希望进行复制的DNA片段进行末端修复，得到经过处理的希望进行复制的DNA片段；或者将希望进行复制的DNA片段进行末端修复，再进行或同时进行3'端加A，得到经过处理的希望进行复制的DNA片段。22.根据项21所述的方法，其中，包括在步骤A-2之前进行的步骤A-1：将样本DNA进行打断，得到希望进行复制的DNA片段。23.一种可利用DNA片段，其是通过项1～22中任一项所述的DNA片段的非特异性复制的方法得到的。24.一种DNA文库的构建方法，其是采用项23所述的可利用DNA片段进行的文库构建。25.根据项24所述的DNA文库的构建方法，还包括：步骤E：将可利用DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；步骤F：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；步骤J：将3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；步骤H：将加接头DNA片段进行PCR，得到PCR扩增产物，完成文库构建。25.一种DNA片段的非特异性复制的试剂盒，其用于实施项1～22中任一项所述的方法，包括：用于加接头的试剂，所述试剂包括接头，用于PCR扩增的试剂，所述PCR扩增的试剂包括引物，和/或用于切割的试剂所述切割的试剂包括具有切割功能的酶。26.根据项25所述的试剂盒，其中，所述接头为具有切割信息的接头，所述引物为具有切割信息的引物，所述切割试剂为至少一种具有切割功能的酶。27.根据项26所述的试剂盒，在所述具有切割信息的接头中，所述切割信息位于所述接头的靠近用于与所述经过处理的希望进行复制的DNA片段相连接的一端；在所述具有切割信息的引物中，所述切割信息位于所述引物的3'端区域。28.根据项26所述的试剂盒，其中，所述切割信息为切割位点。优选地所述切割位点为至少1bp的核苷酸序列；更优选地所述切割位点为至少一个酶切位点或含有至少一个T碱基的碱基序列。29.根据项26所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA片段的非特异性复制的方法，包括：步骤B：将经过处理的希望进行复制的DNA片段加接头，得到加接头的DNA片段；步骤C：使用与所述接头的核苷酸序列相结合的引物对所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤D：采用切割方式将PCR产物进行切割，得到与希望进行复制的DNA片段基本相同的可利用DNA片段。

【技术特征摘要】
1.一种DNA片段的非特异性复制的方法，包括：步骤B：将经过处理的希望进行复制的DNA片段加接头，得到加接头的DNA片段；步骤C：使用与所述接头的核苷酸序列相结合的引物对所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤D：采用切割方式将PCR产物进行切割，得到与希望进行复制的DNA片段基本相同的可利用DNA片段。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头为具有切割信息的接头，所述切割信息位于所述接头的靠近用于与所述经过处理的希望进行复制的DNA片段相连接的一端，优选地，所述切割信息为切割位点；优选地所述切割位点为至少1bp的核苷酸序列；更优选地所述切割位点为至少一个酶切位点或含有至少一个T碱基的碱基序列；优选地，所述具有切割信息的接头是由核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2经退火反应形成的产物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物为具有切割信息的引物，所述切割信息位于所述引物的3'端区域；优选地，所述切割信息为切割位点；优选地切割位点为至少1bp的核苷酸序列；更优选地切割位点为至少一个酶切位点或含有至少一个脱氧尿嘧啶的碱基序列；更优选地，所述的具有切割信息的引物是如SEQIDNO：3所示核苷酸序列和SEQIDNO：4所示核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D中所述切割方式为试剂切割，优选地所述试剂切割是采用切割试剂进行至少一次切割，优选地，所述切割试剂为至少一种具有切割功能的酶；优选地，所述具有切割功能的酶为下组中至少一种：限制性内切酶、外切酶、具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶和具有单链特异性切割功能的酶；优选地所述具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶为UDG或EndonucleaseVIII和UDG的混合物，优选地所述具有单...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁峻彬，张介中，姜锋，杜洋，李小林，玄兆伶，李大为，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，浙江安诺优达生物科技有限公司，安诺优达义乌医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11