一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，由阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3MADEGAG，在生物纳米磁珠表面展示特定阴离子多肽结构，提供的作为修饰位点的功能基团数量多，结合抗体量大，磁珠的生物活性好，特异性较高，实用性好。

Anion peptide carboxylic biological nano magnetic bead and preparation method thereof

The present invention provides an anion polypeptide carboxylation biological nano magnetic bead, which is formed by the fusion of anionic polypeptide polymer through flexible linker connected to the membrane protein of biological nanomagnetic beads. The amino acid residue of the flexible linker is GCVA (DLGGV) 2GVC (GA) 3MADEGAG, and the specific anion polypeptide is displayed on the surface of the biological nano magnetic beads. The structure provides a large number of functional groups as modifier sites, combines large amount of antibody, has good biological activity, high specificity and good practicability.

【技术实现步骤摘要】
一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法
本专利技术涉及纳米磁珠应用和医学检测领域，具体是涉及阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法。
技术介绍
生物纳米磁珠是趋磁细菌生产的一种磁性纳米颗粒，也称为细菌磁颗粒，内核是Fe3O4晶体，外面有一层磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种趋磁细菌生产的生物纳米磁珠，它们的粒径大小和晶体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此外，细菌磁颗粒是生物制备来源，因此具有较好的生物相容性。生物纳米磁珠表面膜上带有大量的功能基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同的特殊功能。细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在表面膜上表达特殊的蛋白质及多肽分子，成为具有特殊生物活性的功能性生物纳米磁珠。纳米磁性颗粒是应用前景非常广阔的一类功能材料，但是裸露的纳米颗粒容易集聚、对生物体具有毒性及生物相容性较差，这些缺点限制了其广泛应用，尤其是在生物医学领域的应用。因此，对纳米材料进行表面的化学修饰，使其带上反应性功能基团(如-COOH，-NH2，-OH等)，或者包裹生物相容性材料(如油酸、SiO2，聚乙二醇等)，一直是研究的热点以及纳米颗粒应用于生物医学领域的重要前提条件之一。化学共沉淀法、水热法、溶胶-凝胶法、微乳液法等一直是化学制备纳米材料并在表面修饰生物相容性物质的常用方法，已经实现通过多代嫁接的方法，在纳米材料表面修饰树状大分子的多聚物。但现有技术中公开的纳米磁性颗粒修饰后的改性生物纳米磁珠性能差异较大，结合抗体量较低，且嫁接修饰大分子后的生物纳米磁珠稳定性较差，非常容易失活，导致难以推广，实用性不强。另一方面，基因改造方法较容易的获得类似化学合成的生物纳米磁珠，表面膜上可以天然带有各种功能基团，但在通过基因改造对于改性生物纳米磁珠的制备过程中，对条件要求非常严格，且DNA转化表达成功率非常低，菌株成活率和纳米磁珠的产率均较低，抑制其广泛的应用。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3MADEGAG。其中G等字母均为氨基酸的缩写，例G为甘氨酸Gly的缩写，C为半胱氨酸Cys的缩写等。进一步地，离子多肽序列以聚谷氨酸(PGA)或聚天冬氨酸(PASP)为主，具有天然富谷氨酸蛋白或人工合成γ-PGA或PASP及其衍生物的特点，分别命名为YR-APE1，YR-APD2。YR-APE1的氨基酸残基序列为：YR-APD2的氨基酸残基序列为：针对趋磁细菌MSR-Ⅰ对阳离子多肽基因序列优化如下：YR-APE1的基因序列为YR-APD2基因序列为本专利技术所提供的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，给定的柔性linker于阴离子多肽聚合物相适配，在生物纳米磁珠表面展示特定阴离子多肽结构，提供的作为修饰位点的功能基团数量多，结合抗体量大，磁珠的生物活性好，特异性较高。且可以作为零代纳米材料，易于进行后续的其他功能修饰和大分子多代嫁接，实用性高。进一步地，所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠由如下步骤制备而成：A、构建细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF缺失的突变体菌株，得到一级重组菌株；B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽，将阴离子多肽与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体；C、将步骤B得到的表达载体导入到步骤A得到的一级重组菌株中，筛选出表达阴离子多肽的二级重组菌株；D、将步骤C得到的二级重组菌种进行发酵培养，生产表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；E、采用多聚物糖基化聚乙二醇PEG对步骤D所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。优选地，所述步骤所述步骤A的具体方法包括如下步骤：(a-1)基因敲除：扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF基因左右两侧共两个长均为300-700bp的同源DNA片段，将所述DNA片段克隆在噬菌体病毒AAV-del微载体上，即得一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mac或AAV-del-maf；(a-2)基因转移：获取AAV-del-mac或AAV-del-maf的核酸序列产物，调节核酸序列产物的浓度为1-3mg/ml，通过电转化的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中；(a-3)菌株筛选：经过梯度筛选，获得mamc或mamf缺失突变的重组菌株，验证后即得一级重组菌株MSRⅠ-dC。阴离子多肽与mamC或mamF的基因融合表达载体的构建方法、筛选菌种的方法、载体导入的方法均可以通过现有技术所公开的方法进行操作，本专利技术不做具体解释。采用基因工程改造方法得到的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，进一步提高了磁珠结合抗体性能，且得到的纳米磁珠活性高，稳定性好，保质期长，抗环境影响能力好，实用性强。另一方面，本专利技术还提供了一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的制备方法，包括如下步骤：A、构建细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF缺失的突变体菌株，得到一级重组菌株；B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽，将阴离子多肽与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体；C、将步骤B得到的表达载体导入到步骤A得到的一级重组菌株中，筛选出表达阴离子多肽的二级重组菌株；D、将步骤C得到的二级重组菌种进行发酵培养，分离纯化生产表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；E、采用多聚物糖基化聚乙二醇PEG对步骤D所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。采用上述基因重组的方法进行阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的制备，细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF的单基因缺失对纳米磁珠产量不会产生影响，构建它们的双突变体有利于充分发挥这个蛋白作为新融合蛋白表达骨架的作用，(MamC或MamF)骨架+linker+目的蛋白可以更好的拿到重组菌种，得到的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠活性好，稳定性高。进一步地，所述菌株选择MSR-Ⅰ野生型菌株，所述步骤A的具体方法包括如下步骤：(a-1)基因敲除：扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF基因左右两侧共两个长均为300-700bp的同源DNA片段，将所述DNA片段克隆在噬菌体病毒AAV-del微载体上，即得一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mac或AAV-del-maf；(a-2)基因转移：获取AAV-del-mac或AAV-del-maf的核酸序列产物，调节核酸序列产物的浓度为1-3mg/ml，通过电转化的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中；(a-3)菌株筛选：经过梯度筛选，获得mamc或mamf缺失突变的重组菌株，验证后即得一级重组菌株MSRⅠ-dC或MSRⅠ-dF。优选地，所述电转化的具体方案为：采用方波电脉冲，电压为3100V-3200V，电脉冲时间是3.1-3.3ms，电本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，其特征在于，所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3MADEGAG。

【技术特征摘要】
1.一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，其特征在于，所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3MADEGAG。2.如权利要求1所述的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，其特征在于，所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为3.如权利要求1所述的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，其特征在于，所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为4.一种权利要求1所述的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A、构建细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF缺失的突变体菌株，得到一级重组菌株；B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽，将阴离子多肽与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体；C、将步骤B得到的表达载体导入到步骤A得到的一级重组菌株中，筛选出表达阴离子多肽的二级重组菌株；D、将步骤C得到的二级重组菌种进行发酵培养，分离纯化生产表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；E、采用多聚物糖基化聚乙二醇对步骤D所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述菌株选择MSR-Ⅰ野生型菌株，所述步骤A的具体方法包括如下步骤：(a-1)基因敲除：扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF基因左右两侧共两个长均为300-700bp的同源DNA片段，将所述DNA片段克隆在噬菌体病毒AAV-del微载体上，即得一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mac或AAV-del-maf；(a-2)基因转移：获取AAV-del-mac或AAV-del-maf的核酸序列产物，调节核酸序列产物的浓度为1-3mg/ml，通过电转化的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中；(a-3)菌株筛选：经过梯度筛选，获得mamc或mamf缺失突变的重组菌株，验证后即得一级重组菌株MSRⅠ-dC或MSRⅠ-dF。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述电转化的具体方案为：采用方波电脉冲，电压为3100V-3200V，电脉冲时间是3.1-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金菊，王红光，
申请(专利权)人：北京中科圆融生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11