阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠及其制备方法，该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，本发明专利技术提供的磁珠对抗体等生物活性物质的载量高，并且具有非常好的高温稳定性。

【技术实现步骤摘要】
阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠及其制备方法
本专利技术涉及功能性纳米磁珠及其制备应用领域，具体是涉及一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠及其制备方法。
技术介绍
细菌磁颗粒是细菌生产的一种磁性纳米颗粒，也称为微生物纳米磁颗粒，内核是Fe3O4晶体，外面有一层磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种细菌生产的细菌磁颗粒，它们的粒径大小和晶体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此外，细菌磁颗粒是生物制备来源，因此具有较好的生物相容性。细菌磁颗粒表面膜上带有大量的功能基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同的特殊功能。细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在表面膜上表达特殊的蛋白质及多肽分子，成为具有特殊生物活性的功能性生物纳米磁珠。细菌磁颗粒是应用前景非常广阔的一类功能材料，但是裸露的细菌磁颗粒容易集聚、对生物体具有毒性及生物相容性较差，这些缺点限制了其广泛应用，尤其是在生物医学领域的应用。因此，对纳米材料进行表面的化学修饰，使其带上反应性功能基团(如-COOH，-NH2，-OH等)，或者包裹生物相容性材料(如油酸、SiO2，聚乙二醇等)，一直是研究的热点以及细菌磁颗粒应用于生物医学领域的重要前提条件之一。化学共沉淀法、水热法、溶胶-凝胶法、微乳液法等一直是化学制备纳米材料并在表面修饰生物相容性物质的常用方法，已经实现通过多代嫁接的方法，在纳米材料表面修饰树状大分子的多聚物。在这过程中，零代纳米材料的制备最为关键，涉及到纳米材料的形状、大小以及表面最初的功能基团的修饰和选择。功能蛋白与细菌磁颗粒结合形成的零代纳米材料长存在结合不牢固，或者中间的linker刚性不够，进而制备的生物纳米磁珠载量低、高温稳定性差。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠具有结合牢固、高温稳定性好的效果。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSerGly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla。进一步的改进，阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)，所述阳离子多肽选自YR-CP1、YR-CP2、YR-CP3或YR-CP4的一种，其中，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR；所述YR-CP2的多肽序列为：CYRQRQTSRRRRRRSCQTQRRAMRCRRRNRLRRRKHRRRYGSRRRRRRYG；所述YR-CP3的多肽序列为：YRVRRSRRRHCSRRRLKRIHRRQRSCRRRKRRSRHRRRHRRGRRKRTCRR；所述YR-CP4的多肽序列为：KNLKKLKKLKCSRRPVRRRRPRVSRKKLKKLSKLVSRRRRRGGRRRCKKL。本专利技术另一方面提供一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法，该制备方法包括如下步骤：A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株；B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株；C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。进一步的改进，步骤A具体方法为：A-1：设计两对引物分别扩增mamC或mamF基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mamC或AAV-del-mamF；A-2：AAV-del-mamC或AAV-del-mamF通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；A-3：电转化后的MSR-I野生型菌株通过洗脱液梯度洗脱，筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamC或mamF缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株。细菌磁颗粒膜上的蛋白有5-6种，其中MamA，MamB是和细菌磁颗粒合成有直接密切的关系，缺少这两个蛋白，细菌磁颗粒的合成会受到严重影响。此外，其他3-4个蛋白MamC，MamD，MamE(MSR-I菌株中可能没有)、MamF单独缺失突变并不会影响细菌磁颗粒的合成，但是若同时缺失2-3个或者全部缺失，会影响细菌磁颗粒的产量，例如全部缺失，会使细菌磁颗粒产量下降到野生型(未突变)磁珠产量的20％左右。经过突变研究和产量分析，最后发现MamC和MamF两个蛋白同时缺失部分膜外蛋白，并不会造成细菌磁颗粒产量的显著下降(约为野生型产量的85％-90％)，而且这两个蛋白的表达水平相近，估计是和它们主要作为结构支撑蛋白有关，构建它们的双突变体有利于充分发挥这个蛋白作为新融合蛋白表达骨架的作用。mamC和mamF的基因敲除载体，本专利技术中有提到使用噬菌体AAV-del微载体，它和传统质粒的区别在于，质粒是可以在染色体之外单独存在，能自我复制，可在细胞中长期存在，不易丢失；微载体则不能在染色体之外单独自我复制，只有整合到染色体中才能长期存在，较易丢失，因此用来进行基因敲除，遗传背景比较干净，没有太多外来基因的干扰和污染。进一步的改进，步骤A-2电转化条件为：方波脉冲，电压3100V-3200V，电脉冲时间3.1-3.3ms，电脉冲次数1-2次。一般细菌间基因转移是通过接合的方式(亲本接合)，这容易造成转移基因的缺少，特别是对大片段基因的质粒。电转化方法，是通过瞬时电流在细胞上形成孔洞，使得溶液中的DNA基因片段能够通过孔洞进入细胞内，完成转化。本专利技术在进行进一步的研究过程中对电转化的条件进行优化，该电转化条件可以显著提高菌株成活率和电转化成功率。进一步的改进，步骤A-3所述的洗脱液由如下重量份的成分组成：蔗糖25-30庆大霉素10-15吐温802-3磷酸盐缓冲液50-60磷脂酰乙醇胺5-10。通过对洗脱液的优化，可以显著提高菌株成活率。进一步的改进，步骤B具体方法为：B-1：将阳离子多肽的基因序列通过linker与mamC基因或mamF基因进行融合，得到新的融合基因片段；B-2：将新的融合基因片段克隆到表达载体pBRC上，分别得到基因表达载体；B-3：通过电转化的方式分别将基因表达载体导入一级重组菌中，验证正确后筛选表达阳离子多肽的重组菌株，即二级重组菌株。进一步的改进，步骤C培养发酵的具体步骤包括：C-1：在发酵罐中加入第一培养基，对步骤B获得的二级重组菌株进行预培养，培养条件为：5-10％氧气和90-95％氮气的混合气体，培养时间16h，培养温度为37℃，优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，其特征在于，所述阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSer Gly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla。

【技术特征摘要】
1.一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，其特征在于，所述阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSerGly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla。2.如权利要求1所述的阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，其特征在于，所述阳离子聚合物为PEI，所述阳离子多肽选自YR-CP1、YR-CP2、YR-CP3或YR-CP4的一种，其中，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR；所述YR-CP2的多肽序列为：CYRQRQTSRRRRRRSCQTQRRAMRCRRRNRLRRRKHRRRYGSRRRRRRYG；所述YR-CP3的多肽序列为：YRVRRSRRRHCSRRRLKRIHRRQRSCRRRKRRSRHRRRHRRGRRKRTCRR；所述YR-CP4的多肽序列为：KNLKKLKKLKCSRRPVRRRRPRVSRKKLKKLSKLVSRRRRRGGRRRCKKL。3.一种权利要求1所述的阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株；B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株；C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A具体方法为：A-1：设计两对引物分别扩增mamC或mamF基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mamC或AAV-del-mamF；A-2：AAV-del-mamC或AAV-del-mamF通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；A-3：电转化后的MSR-I野生型菌株通过洗脱液梯度洗脱，筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamC或mamF缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株。5.如权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金菊，王红光，
申请(专利权)人：北京中科圆融生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11