抗CBirl杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO：C2016162，以及由此杂交瘤细胞株产生的抗CBirl单克隆抗体。本发明专利技术还涉及基于此杂交瘤株的工程抗体及其在免疫检测工具中的应用，用此工程抗体能够替人源血液作为阳性对照。

Anti CBirl hybridoma cell lines and monoclonal antibodies produced

The present invention discloses a hybridoma cell line, whose preservation is CCTCC NO:C2016162, and the anti CBirl monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line. The invention also relates to the engineering antibody based on the hybridoma strain and its application in the immunoassay tool. The antibody can be used as the positive control of the human blood.

【技术实现步骤摘要】
抗CBirl杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体
本专利技术涉及免疫学
，特别涉及制备一种制备分泌抗CBirl的单克隆抗体杂交瘤细胞株，以及基于该杂交瘤细胞株制备的CBirl嵌合抗体在炎症性肠病检测中的应用。
技术介绍
炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，IBD)是一种慢性非特异性肠道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)和克罗恩病(Crohn’sdisease，CD)，近10多年来在我国发病率呈逐步增高趋势。IBD的临床表现复杂多样，不仅有消化道症状，还可有肠外表现。由于症状为腹痛、腹泻、便血等非特异性肠炎表现，CD与UC，以及IBD与结核性肠炎等其他肠道慢性疾病很难鉴别诊断。目前鉴别UC与CD的生物标志物主要集中在自身免疫抗体与抗微生物抗体，CBirl是从一种自发产生结直肠炎的C3H/HeJBir大鼠的血清学发现的细菌鞭毛蛋白。研究证明CBirl参与多种炎症反应，其机制与核因子NF-KB的激活有关。近来研究发现，CBirl与某些非典型克隆恩病的发病有关，通过检测血清中抗OmpC的IgA和IgG抗体可以辅助诊断IBD。应用免疫检测技术，如酶联免疫法、化学发光法、免疫层析法等测定样品中抗体的浓度是常用的检测方法。在此类试验中，必须设立阳性对照孔，阳性对照多用临床病人的血清或其他形式的人血清。但人源性血制品，很可能含有致病性传染物质，对操作者存在潜在的威胁，同时在配制阳性对照过程中需要大量血清或血浆，而有些病的血清或血浆又比较难得到。因此应用人源血液作为阳性对照，对于制备大量检测试剂盒产品而言，原料受到客观的限制。所以需寻求一种阳性对照替代品应用于CBirl的IgA或IgG抗体检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种抗CBirl单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。本专利技术的另一个目的是：提供一种基于CBirl单克隆抗体杂交瘤细胞株的工程抗体及其在医学检验领域的用途。本专利技术提供的CBirl单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC)，保藏日期为2016年8月12日，保藏编号为CCTCCNO：C2016162。本专利技术提供了如下的技术方案：研制CBirl单克隆抗体杂交瘤，基于此杂交瘤细胞株制备人源化嵌合抗体，即将CBirl的单克隆抗体的轻、重链可变区基因插入到含有人源IgA或IgG抗体恒定区基因的表达载体中，转入动物细胞中表达得到的CBirl的人源化IgAFc或人源化IgGFc的嵌合抗体，这两种CBirl人源化IgAFc或人源化IgGFc嵌合抗体可分别作为检测抗CBirl的IgA或IgG抗体的阳性对照物。本专利技术方案包括如下步骤：(1)CBirl抗原蛋白制备；(2)CBirl蛋白多次免疫BALB/c小鼠，ELISA法检测免疫小鼠血清效价；(3)免疫BALB/c小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合；(4)有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞；(5)杂交瘤的单克隆抗体鉴定：终获得能分泌抗CBirl特异性抗体的杂交瘤细胞株，亚型鉴定为IgG1，ELISA测效价为1∶320000；(6)基于CBirl单克隆抗体杂交瘤细胞株，通过工程抗体技术，用人源化IgAFc或人源化IgGFc段替换CBirl单克隆抗体的鼠源Fc段，制备抗CBirl的嵌合抗体；(7)CBirl嵌合抗体配制的校准品及其应用。本专利技术的优点是：(1)本专利技术所述杂交瘤细胞株染色体稳定，能稳定地分泌抗体。(2)本专利技术所述杂交瘤细胞株分泌的抗体效价高，培养上清效价达1∶32万。(3)基于本专利技术所述杂交瘤细胞株制备的嵌合抗体可替代人源血液作为阳性对照，对于制备大量检测试剂盒产品而言，避免了人血液原料来源的客观限制，也更安全。保藏信息用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为：抗人CBirl单克隆抗体杂交瘤细胞株HR03211-7；保藏单位全称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称：CCTCC；保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路武汉大学；保藏日期：2016年8月12日；保藏编号：CCTCCNO：C2016162。附图说明图1纯化后单抗的电泳图；图2CBirl抗体IgA荧光定量免疫层析校准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1：CBirl抗原蛋白制备1.试剂与仪器1)试剂大肠杆菌宿主菌DH5α、BL21(DE3)，克隆载体pCR2.1T-vector，表达质粒pET28a(+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA连接酶，DNA聚合酶rTaq、LATaq以及限制性内切酶BamHI、HindIII和EcoRI、BamHI，DL2000DNAMarker、T4DNA连接酶，低分子量标准蛋白，DNA胶回收试剂盒，IPTG等2)仪器普通摇床SCS-24；隔水式恒温电热培养箱；Biophotometer分光光度计、台式冷冻离心机Centrifuge5810R、台式离心机MiniSpin；高速冷冻离心机；蛋白质电泳仪以及凝胶成像系统；PCR仪；超声裂解仪；恒温金属浴；HIS蛋白纯化柱等。2.实验方法1)载体构建：设计引物GGAATTCCATATGGGCAGTTGCAATTTTCTAGAT和CGCGGATCCCCCAAGTAGCTGGGATTACAGA从模板DNA中PCR扩增出CBirl片段，胶回收试剂盒回收片段后连接到pCR2.1克隆载体进行测序鉴定。将鉴定正确的序列克隆至表达载体pET28a(+)中，酶切位点为EcoRI、BamHI，同时载体上有6×HIS标签，便于后续的蛋白纯化。2)表达将得到的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选阳性表达菌株。将筛选出来的阳性菌液按1∶1000的比例接种加有Kan抗性的LB培养基中，每个菌接种两管，一管用于诱导，另一管用于非诱导对照，同时要接种一管空质粒菌作对照。37℃过夜培养至OD600值约为0.4-0.6时，诱导管和空质粒对照管加入IPTG至终浓度为1mmol/L，非诱导对照不加，最终选择表达能力高的两个菌，用于大量的蛋白的表达。并按照常规的SDS-PAGE方法对表达产物进行鉴定。3)纯化将表达的产物用HIS蛋白纯化柱纯化蛋白，并透析脱盐，经测定纯化后的蛋白浓度为510mg/L。实施例2：抗CBirl杂交瘤的制备1.动物免疫纯化的CBirl抗原与完全弗氏佐剂等体积混和，用双注射器互推法乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫。融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的100μg抗原，3天后进行细胞融合。2.细胞融合融合前将PEG1500置于37℃培养箱中预温，吸取1×107个SP2/0骨髓瘤细胞悬液和5×107个来源于SPF级Balb/c小鼠脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1∶5)至一个50ml离心管中，补加30mlIMDM不完全培养基，充分混匀，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50％PEG1500溶液，在离管本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组表达的CBir1蛋白免疫小鼠获得的抗CBir1杂交瘤细胞株HR03211‑7，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：C2016162。

【技术特征摘要】
1.一种重组表达的CBir1蛋白免疫小鼠获得的抗CBir1杂交瘤细胞株HR03211-7，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：C2016162。2.一种抗CBir1的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备CBir1免疫检测工具中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈菲，周鹏飞，霍如松，
申请(专利权)人：苏州和锐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32