一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和灵敏度高、特异性好的创伤弧菌检测试剂盒，属于创伤弧菌免疫检测领域。所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016146。所述创伤弧菌检测试剂盒包括以下组分：酶标板、创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体、HRP酶标记鼠抗、封闭液、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照品和空白对照品。本发明专利技术提供的创伤弧菌检测试剂盒能够特异性检测创伤弧菌，灵敏度高，对创伤弧菌膜蛋白样品的最低检测限为78ng。

Hybridoma cell line, monoclonal antibody against Vibrio membrane protein and detection kit for Vibrio vulnificus

The invention provides a hybridoma cell line, a monoclonal antibody against Vibrio vulnificus membrane protein and a high sensitivity and specific detection kit for Vibrio vulnificus, which belongs to the immuno detection field of Vibrio vulnificus. The hybridoma cell line is kept in the typical culture preservation center of China, with the preservation number CCTCCNO:C2016146. The test kit for the detection of Vibrio vulnificus includes the following components: the enzyme labeled plate, the monoclonal antibody to the membrane protein IgG of Vibrio vulnificus, the HRP enzyme labelled rat resistance, the sealing solution, the antibody diluent, the washing liquid, the chromogenic solution, the terminating solution, the positive control and the blank control. The detection kit for Vibrio vulnificus provided by the present invention can specifically detect Vibrio vulnificus with high sensitivity, and the minimum detection limit for Vibrio vulnificus membrane protein samples is 78ng.

【技术实现步骤摘要】
一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌检测试剂盒
本专利技术属于创伤弧菌疾病特异性检测
，具体涉及一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌检测试剂盒。
技术介绍
创伤弧菌是公认的人鱼共患病的条件致病菌，对近海和河口环境的鳗鱼、黄姑鱼、牡蛎、大菱鲆、石斑鱼等水产名贵经济动物以及养殖从业人员危害大，该菌分为生物I型、生物II型、生物III型3个生物型，一般感染创伤弧菌生物I型的病人致死率高达60％以上；创伤弧菌生物II型主要感染鳗鲡等咸淡水养殖品种，导致感染鱼大量死亡，造成严重经济损失。因此，创伤弧菌疾病的诊断与预防尤为重要和关键，目前创伤弧菌病还缺乏快速、准确的诊断方法和免疫监测手段。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和灵敏度高、特异性好的创伤弧菌检测试剂盒，所述试剂盒可应用于创伤弧菌病疫苗免疫效果评价、免疫应答水平监测，以及水产动物创伤弧菌病的快速诊断。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016146。本专利技术还提供了一种创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株分泌产生。本专利技术还提供了一种创伤弧菌检测试剂盒，包括以下组分：酶标板、创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体、HRP酶标记鼠抗、封闭液、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照品和空白对照品。优选的，所述创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体腹水效价大于1：128000。优选的，所述抗体稀释液为质量浓度0.8～1.2％的BSA-PBST溶液。优选的，所述抗体稀释液的pH值为7.1～7.3。优选的，所述封闭液为质量浓度1.6～2.4％的BSA-PBST溶液。优选的，所述的洗涤液为PBST溶液；所述洗涤液的pH值为7.0～7.4。优选的，所述显色液包括底物显色A液和底物显色B液；所述底物显色A液包括26～28g/L的醋酸钠，3.0～3.5g/L的柠檬酸，0.5～0.7ml/L30wt％的双氧水；所述底物显色B液包括0.35～0.45g/L的乙二胺四乙酸二钠，1.8～2.0g/L的柠檬酸，90～110ml/L的甘油，0.28～0.32g/L的四甲基联苯胺；在使用所述显色液前将等体积的底物显色A液和底物显色B液混匀。优选的，所述终止液为质量浓度0.10～0.11％的硫酸溶液。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的杂交瘤细胞株能够分泌产生创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体，所述创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体的效价高，腹水效价大于1：128000；采用该单克隆抗体，酶标板、HRP酶标记鼠抗、封闭液、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照品和空白对照品组成一种创伤弧菌检测试剂盒，该试剂盒能够特异性检测创伤弧菌，灵敏度高，对创伤弧菌膜蛋白样品的最低检测限为78ng。附图说明图1为实施例1中创伤弧菌膜蛋白的分离纯化SDS-PAGE电泳图；图2为实施例3中不同稀释度的创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体的特异性检测检测结果图；图3为实施例4中创伤弧菌检测试剂盒对常见的不同水产细菌菌株的检测结果图。生物保藏说明本专利技术所述的杂交瘤细胞株VvmAb1m1n7保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心；保藏编号为CCTCCNO:C2016146，保藏时间为2016年12月22日。具体实施方式本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016146。所述杂交瘤细胞的保藏时间为2016年12月22日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心。本专利技术中所述杂交瘤细胞株能够分泌生产针对创伤弧菌膜蛋白IgG的单克隆抗体；所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的腹水效价大于1：128000。本专利技术中所述杂交瘤细胞株的制备方法具体的包括以下步骤：1)制备获得创伤弧菌膜蛋白；2)用所述的创伤弧菌膜蛋白免疫小鼠，获得免疫后小鼠；3)当所述免疫后小鼠的血清效价大于1.0×10-4后，取免疫后小鼠的脾细胞进行细胞融合，筛选获得阳性细胞；4)将所述阳性细胞进行单细胞克隆化获得杂交瘤细胞株。在本专利技术中，所述的创伤弧菌膜蛋白来源于创伤弧菌，在本专利技术中优选的将创伤弧菌进行扩增获得大量创伤弧菌，然后从获得的大量创伤弧菌中分离膜蛋白。在本专利技术具体实施过程中，所述创伤弧菌可以为市售的创伤弧菌，也可以是从携带创伤弧菌的水产动物的组织中分离获得的，所述分离方法采用本领域常规的细菌分离方法即可，无其他特殊要求；所述创伤弧菌优选的在扩增前进行复苏，本专利技术对所述复苏的方法没有特殊限定，采用本领域常规的菌种复苏方法即可；所述复苏优选的采用灭菌TSA平板培养复苏创伤弧菌。本专利技术中所述的创伤弧菌的扩增优选的采用液体培养基培养扩增所述创伤弧菌，所述液体培养基优选的为TSB培养液；所述扩增的温度优选的为26～30℃，更优选的为28℃。本专利技术在扩增获得大量创伤弧菌后，收集创伤弧菌菌体；本专利技术中所述收集创伤弧菌菌体的方法优选为离心；所述离心的转速优选为5500～6500rpm，更优选为6000rpm，所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min，本专利技术在离心后收集固相组分即为创伤弧菌菌体。本专利技术在获得创伤弧菌菌体后，用Tris-HCl溶液将获得的创伤弧菌菌体重悬置于4℃备用；所述Tris-HCl溶液的浓度优选的为10mM；所述Tris-HCl溶液的pH值优选的为7.4。本专利技术中所述膜蛋白分离的方法优选的为TritonX-114法，具体方法步骤参考《大肠杆菌外膜蛋白的分离及其双向电泳图谱的建立》，现代生物医学进展2009，9(2)201-205。本专利技术获得创伤弧菌膜蛋白后，优选的对其进行SDS-PAGE电泳分析，在36KD附近出现条带，说明所述创伤弧菌膜蛋白的分子量在36KD左右。本专利技术在获得创伤弧菌膜蛋白后，用所述的创伤弧菌膜蛋白免疫小鼠获得免疫后小鼠。在本专利技术中所述小鼠优选的为雌性小鼠；更优选的为8～12周龄的Balb/c雌性小鼠；本专利技术中，所述小鼠优选的购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。在本专利技术中所述免疫小鼠的创伤弧菌膜蛋白的用量为优选的为65～75μg/只，更优选的为70μg/只；本专利技术中所述免疫的方法优选的为内静脉注射免疫小鼠，每间隔10天免疫一次。本专利技术优选的在4次免疫后对小鼠摘眼球取血，用ELISA法检测抗血清效价。本专利技术在所述免疫后小鼠的血清效价大于1.0×10-4后，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选获得阳性细胞。在本专利技术中所述细胞融合采用本领域常规的方法，无其他特殊要求。本专利技术在所述细胞融合后，用优选的方法对融合后的细胞进行筛选；在本专利技术中所述筛选方法优选的为ELISA方法和亲和力排序。能够在HAT培养液正常生长繁殖且ELSIA检测为阳性(P/N≥2.1)的细胞即为阳性融合细胞。本专利技术在获得阳性细胞后，将所述阳性细胞进行单细胞克隆化获得单克隆阳性杂交瘤细胞株。在本专利技术中所述单细胞克隆化即为从筛选到的阳性细胞分离单细胞，然后对分离获得的单细胞进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016146。

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016146。2.一种创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。3.一种创伤弧菌检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：酶标板、权利要求2所述的创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体、HRP酶标记鼠抗、封闭液、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照品和空白对照品。4.根据权利要求3所述的创伤弧菌检测试剂盒，其特征在于，所述创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体的腹水效价大于1：128000。5.根据权利要求3所述的创伤弧菌检测试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液为质量浓度0.8～1.2％的BSA-PBST溶液。6.根据权利要求5所述的创伤弧菌检测试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液的pH值为7.1～7.3。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：许斌福，龚晖，池洪树，郑在予，方冬兰，黄河，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35