与桃垂枝基因紧密连锁的分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与桃垂枝基因紧密连锁的分子标记及其应用，以期应用于桃垂枝分子标记辅助选择和优良桃种质资源选育。本发明专利技术筛选得到一种与桃垂枝基因紧密连锁的SNP分子标记，为WESNP‑20.83、WESNP‑20.99，WESNP‑20.83位于桃基因组Pp03的20.839Mb处，其核苷酸为G或C；WESNP‑20.99位于桃基因组Pp03的20.998Mb处，其核苷酸为C或T。并得到一种与垂枝基因紧密连锁的InDel标记WEInDel‑21.61。本发明专利技术基于开发的分子标记引物提供用于辅助筛选优良桃种质资源的方法，可以实现早期对桃垂枝性状进行分子鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。

Molecular markers closely linked to peach branch genes and their application

The invention discloses a molecular marker closely linked with the peach drooping branch gene and its application, in order to be applied to the selection of molecular marker assisted selection and selection of fine peach germplasm resources. The invention has screened a SNP molecular marker closely linked to the peach drooping branch gene, which is WESNP 20.83, WESNP 20.99, and WESNP 20.83 located at 20.839Mb of the peach genome Pp03; its nucleotide is G or C; WESNP 20.99 is located in the 20.998Mb place of the peach genome Pp03. A WEInDel marker InDel, closely linked to the vertical branch gene, was obtained. Based on the developed molecular marker primers, the invention provides a method for auxiliary screening of fine peach germplasm resources, and can realize molecular identification and screening of peach drooping branches in early stage, which has the advantages of high efficiency, limited and accurate.

【技术实现步骤摘要】
与桃垂枝基因紧密连锁的分子标记及其应用
本专利技术涉及桃垂枝的分子标记辅助选择
，具体涉及一种与桃垂枝基因紧密连锁的分子标记及其应用。
技术介绍
桃[Prunuspersica(L.)Batsch]是原产我国的重要落叶果树，已有3000多年的栽培历史；在我国，桃是第三大落叶果树，广泛栽培于全国各地，是农业生产的一个重要组成部分。桃树生长型有多种，并可稳定的遗传，如矮生型（DW，dwdw）、半矮生型（SD，semi-dwarf）、柱型（PI，brbr）、紧凑型（CT，Ct）和垂枝型（WE，plpl），新树型的开发和应用是我国育种工作的重要组成部分。其中矮生、柱形、紧凑等树形对于改良桃树栽培生产模式意义重大，而垂枝型因其枝条下垂具有较好的观赏价值，是观赏桃主要的育种方向。垂枝桃（Prunus.persicavar.Pendula）作为桃的一个变种，枝条下垂如柳，具有极高的观赏价值。YamazakiK.（1987）、BassiD（2000）和DennisJ（2005）通过对桃树的柱形、垂枝、正常树形等杂交发现，垂枝性状受一个单隐性基因（pl）控制。DirlewangerE（1994）发现了垂枝性状（pl）的RAPD标记，遗传距离为11.4cM（Centimorgan）和17.2cM，但遗传距离太大，不足以说明是一个精确的标记，难以实现早期对桃垂枝性状进行分子鉴定。因此，亟需开发并获得与桃垂枝性状紧密连锁的标记，以实现早期对桃垂枝性状进行分子鉴定，为提高育种效率奠定基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种与桃垂枝基因紧密连锁的分子标记及其应用。选择垂枝桃性状分离后代为试材，通过确定与桃垂枝基因紧密连锁的分子标记可以实现早期对目标性状进行分子鉴定。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：筛选一种与桃垂枝基因紧密连锁的SNP分子标记，命名为WESNP-20.83和/或WESNP-20.99；所述WESNP-20.83位于桃基因组Pp03的20.839Mb处，该位点及其侧翼的核苷酸序列为：GTCTCTGCTCGGTAATTATTCCTCTTTGCTTGTTTGTGTTCATTGGAAAGTTGGGAAAGTTGGSAAAGTTGGCAAAGTTTTGCATAGATGGAATTGGTAGGGCACAAAAGTTTTAGATAATTGT；所述WESNP-20.99位于桃基因组Pp03的20.998Mb处，该位点及其侧翼的核苷酸序列为：ACAGAAAACTCATCAAGTTTCTGGAATTTATTGAACAAAATAAACCAAAATAACAAACTAAAATAACGCTGTCAAAAAGAAAAACCAACCGYACTGCTATTAATCTTCCTTTGAAACATGACATAGAGAACGTCACTTAATTGTTCTTATTTTTATACAAACGATATTTAAAATAAAATAAAAA，所述序列中S为G或C，Y为C或T。优选的，垂枝基因型S为C，Y为T。设计一种检测与桃垂枝基因紧密连锁的SNP分子标记的引物对，其核苷酸序列为：CCACATCCCTCTCAGCCTCA和GATCCTGAGCAATGCCACCC，和/或TCTATAATCCCCTCAACCGCCA和GTTTAAGGGATCAAGGGCCGT。发现一种与垂枝基因紧密连锁的InDel标记，命名为WEInDel-21.61，其序列的引物为：GGGGCCCAAGGAAAGGATTT，和/或GTAACCCAATGCTTGCAAAGTCA。所述与桃垂枝基因紧密连锁的SNP分子标记在桃垂枝分子标记辅助选择中的应用。优选的，用于检测杂交后代单株的引物对为：CTCTCCAACTTCGCGATTGTGA和TGGGCTGGGAAAACTGATCAAA。所述与桃垂枝基因紧密连锁的SNP分子标记在优良桃种质资源选育中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果在于：1.本专利技术采用基于SNP的第三代分子标记技术，结合构建的分离自交群体，采用图位克隆的方法，对桃垂枝的基因进行了精细定位，在精细定位区域内，开发出稳定的、共显性和多态性的SNP标记，获得了与桃垂枝基因紧密连锁的SNP分子标记，分别命名为WESNP-20.83和WESNP-20.99。由于研究的对象具有垂枝性状的种质，可依据获得的紧密连锁标记克隆目标性状的基因，应用于分子辅助选育优良观赏桃品种。2.本专利技术不仅为桃垂枝基因的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有桃垂枝基因的桃树新品种提供了高效途径。3.本专利技术基于开发的分子标记引物提供用于辅助筛选具有特定桃垂枝的桃树新品种的方法。4.通过本专利技术提供的分子标记，可以实现早期对桃垂枝性状进行分子鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。5.本专利技术方法简便、快捷，有很好的应用推广前景。附图说明图1为垂枝表型图；图2为垂枝与普通表型对比图；图3为与垂枝基因连锁的InDeL标记WEIndel-21.61的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图4为与垂枝基因完全连锁的SNP标记WESNP-20.99的测序峰图和SNP位点示意图；图5为与垂枝基因紧密连锁的SNP标记WEYZ-SNP的测序峰图和SNP位点示意图；图6为检测杂交后代单株的SNP标记WEYZ-SNP在亲本‘新乡144’重测序突变位点示意图。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例一：杂交分离群体垂枝表型的鉴定根据桃树枝条的直立与垂枝程度，进行表型评价，其中枝条新稍下垂似垂柳状为垂枝型，如图1所示；枝条新稍负地向上生长为普通型，如图2所示。以“新乡144”为亲本自交，获得自交后代152株实生苗，定植后于2016年4月进行表型评价。通过对后代单株进行表型评价，发现其中普通96株，垂枝56株，二者比例接近3：1，P值为0.700，符合孟德尔遗传规律，垂枝性状为隐形单基因控制。实施例二：基因组DNA的提取采用CTAB法提取桃叶片基因组DNA，具体步骤如下：（1）取桃幼嫩叶片约30mg，放入1.2mL八联排离心管，每孔各加入1个5mm钢珠，放入96孔底座，液氮充分冷冻；（2）手动摇晃数次，保证钢珠充分打碎样品，DNA自动研磨仪（上海领成生物科技有限公司）进行研磨，频率30Hz，时间90s；（3）用300mL量程8通道移液器加入配制好的CTAB液600μL，放入60℃电热恒温鼓风干燥箱加热30min，其间约每10min轻摇匀；（4）放入冷冻离心机（Eppendorf5810R）4℃条件下，4000rpm瞬时离心；加入氯仿和异戊醇混合液，体积比为24：1，直至1.2mL的八联排离心管满载线，后缓慢颠倒混匀5min，放入冷冻离心机（Eppendorf5810R）4℃条件下，4000rpm，离心10min；（5）分别吸取上清液150µL于两个96孔PCR板中，其中一板加入等体积的无水乙醇，于-20℃冰箱1小时，之后，4℃条件下，4000rpm，离心10min，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与桃垂枝基因紧密连锁的SNP分子标记，命名为WESNP‑20.83和/或WESNP‑20.99，其特征在于：所述WESNP‑20.83位于桃基因组Pp03的20.839Mb处，该位点及其侧翼的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述WESNP‑20.99位于桃基因组Pp03的20.998Mb处，该位点及其侧翼的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述序列中S为G或C，Y为C或T。

【技术特征摘要】
1.一种与桃垂枝基因紧密连锁的SNP分子标记，命名为WESNP-20.83和/或WESNP-20.99，其特征在于：所述WESNP-20.83位于桃基因组Pp03的20.839Mb处，该位点及其侧翼的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述WESNP-20.99位于桃基因组Pp03的20.998Mb处，该位点及其侧翼的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述序列中S为G或C，Y为C或T。2.根据权利要求1所述的与桃垂枝基因紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，垂枝基因型S为C，Y为T。3.一种检测如权利要求1所述的与桃垂枝基因紧密连锁的SNP分子标记的引物对，其特征在于，其核苷酸序列为：CCACATCCCTCTCAGCCTCA和GATCCTGAGCAATGCCACCC，和/或TC...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁振华，王志强，张南南，牛良，崔国朝，潘磊，曾文芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41