甘蓝型油菜高油酸QTL及与其紧密连锁的分子标记制造技术

本发明专利技术属于油菜分子标记制备技术领域，具体涉及甘蓝型油菜高油酸QTL及与其紧密连锁的分子标记。本发明专利技术筛选得到新的油酸含量QTL紧密连锁的分子标记BnA129，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3和/或4所示。构建得到检测分子标记OLEA9的引物BnA129，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和2所述。本发明专利技术的数量性状位点OLEA9及分子标记可在甘蓝型油菜高油酸性状改良中的分子标记辅助选择以及在油酸性状位点精细定位和图位克隆中应用。

High oleic acid QTL and its closely linked molecular markers in Brassica napus L.

The invention belongs to the technical field of molecular marker preparation of Brassica napus, and specifically relates to the high oleic acid QTL of Brassica napus and its closely linked molecular markers. The present invention selects a new molecular marker BnA129, which is closely linked to QTL with oleic acid content, and its nucleotide sequence is shown in sequence list SEQ ID NO:3 and / or 4. A primer BnA129 was constructed to detect molecular marker OLEA9, and its nucleotide sequence was as follows: sequence list SEQ ID NO:1 and 2. The quantitative trait loci OLEA9 and molecular markers in this invention can be used in the molecular marker assisted selection in the improvement of high oleic acid character of Brassica napus and the application in fine location and mapping of oleic acid trait loci.

【技术实现步骤摘要】
甘蓝型油菜高油酸QTL及与其紧密连锁的分子标记
本专利技术属于油菜分子标记筛选
，具体涉及甘蓝型油菜高油酸QTL及与其紧密连锁的分子标记。本专利技术的油酸QTL及与之紧密连锁的分子标记可用于甘蓝型油菜油酸性状改良，以及在油酸性状位点精细定位和图位克隆中应用。
技术介绍
油菜是世界上最重要的油料作物之一，植物油的食用和加工特性及品质主要取决于种子脂肪酸组分。低芥酸油菜中主要脂肪酸包括三种不饱和脂肪酸，即油酸，亚油酸和亚麻酸。这三种脂肪酸的比例对菜籽油的品质影响很大。油酸是一种十八碳单不饱和脂肪酸。高油酸品种在加工、存储和煎炸过程中不易被氧化，加工过程中不产生不健康的反式脂肪酸，降低了患心血管疾病的风险，并且可以降低胆固醇。高油酸菜籽油可用于生产优质生物柴油，是重要的可再生性能源原料。因此，低芥酸的基础上进一步的品质改良的重要目标是要提高油菜种子中油酸含量。前人研究定位了油菜控制脂肪酸合成的QTL。鉴定到了一些控制脂肪酸成分变异的主效基因(Huetal2006；Zhaoetal2008；Yanetal2011；Zhaoetal2012；Yangetal2012)。前人的研究普遍认为，油酸含量受2对主基因控制，遗传方式为加性模式，其中位于N5连锁群的主效QTL被认为是FAD2基因，其它大部分位点主要分布在1、2、3、5、6、8、11、13和18连锁群上。Hu等(2006)从两个双低甘蓝型油菜构建的DH群体中分别定位了两个油酸和两个亚油酸的QTL，前者位于N1和N5连锁群上，并且在N5上的主效QTL区域开发了本FAD2基因的等位特异标记，而亚油酸QTL则定位在N4和N14上，同样将开发的FAD3标记定位到主效QTL的置信区间内。Zhao等(2008)在利用两个双高甘蓝型油菜品种构建的DH群体中，对各种脂肪酸组分QTL进行了全基因扫描，在四个地点中发现各种脂肪酸含量QTL1-8个，对油酸的QTL定位中，分别在N18、N2和N8发现7个QTL共解释59％的表型变异，其中位于N18上的主效QTL解释变异24％，然而未在N5和N15上发现相同的QTL，认为存在不同于N5和N15的新位点。控制脂肪酸合成的分子机制是非常复杂的，不同的遗传材料，甚至不同的定位方法都可能导致不一样的定位结果。综上所述，油菜油酸含量是由多基因控制的复杂数量性状，控制油酸的基因除了一个主基因FAD2外，还有微效多基因的影响。目前见诸报道的生产上用到的控制油酸含量的基因基本上是FAD2基因，对其他控制油酸含量的QTL变异的遗传基础还不清楚。因此，利用不同材料开展油酸含量变异的遗传分析和QTL定位，发掘新油酸QTL，对于高油酸性状的改良十分必要，在此基础上开发紧密连锁的分子标记将能加速油菜高油酸育种的进程。
技术实现思路
本专利技术包括鉴定出了一个新的控制油菜种子中油酸含量的数量性状遗传位点(QTL)，并在此基础上开发了与其紧密连锁的共显性分子标记。新发现的QTL可用于油菜高油酸性状的改良。新开发的分子标记可用于甘蓝型油菜油酸性状改良中的分子标记辅助选择，以及在油酸性状QTL精细定位和图位克隆。本专利技术可为油菜高油酸育种提供新资源，并加快油菜油酸性状的改良进程，从而提高油菜育种的准确性和选择效率。本专利技术是通过以下方案实现的：申请人通过筛选和杂交育种得到一个甘蓝型油菜新的高油酸QTL及与其紧密连锁的分子标记，通过如下步骤制备得到：a)以甘蓝型油菜品系ZP1作父本(甘蓝型油菜品系ZP1的油酸含量为67.68％,甘蓝型油菜ZP1,BrassicanapusL.ZP1的种子已于2017年11月10日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：P201722)与甘蓝型油菜品系甲A254作母本(油酸含量72.296％，中国专利技术专利，专利号为ZL2009102734352；公开号CN101824472A)杂交，得到杂种F1；b)种植杂种F1，取植株的花蕾通过小孢子培养(余凤群等，提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究，作物学报，1997，23(2)：165-168)获得定位用DH(加倍单倍体)群体；c)提取分离DH群体每一个株系的基因组DNA，采用SSR(简单序列重复)和InDel(插入缺失)标记引物进行PCR扩增，获得每个株系的基因型；d)基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记信息构建甘蓝型油菜遗传连锁图(遗传连锁图的构建采用MAPMAKER3.0(Lincoln等,1992)软件进行)；e)测定DH群体每个系成熟种子的油酸含量，以其所占总脂肪酸含量的百分比(％)表示；f)将DH群体每个株系的油酸含量与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析(QTL检测采用WinQTLcart2.5(Wangetal，2012)软件中的CIM作图法进行)，以2.5为LOD阈值，将大于2.5界定为一个QTL位点；g)上述分析步骤在A5连锁群和A9连锁群鉴定到两个稳定的QTL，其中在A9连锁群上QTL位点OLEA9是一个新发现的QTL；h)选择仅含A9位点油酸含量为63.79％的常规品种华双5号做父本与母本ZP1配制杂交组合F1；i)利用二代测序技术(WeiLetal,2013)对步骤h)的亲本ZP1和华双5号进行重测序确定其基因型，以甘蓝型油菜参考基因组序列为参照，找出两亲本间在QTL区段内存在的序列差异，得到InDel类型的DNA标记。发现InDel标记BnA129处于A9连锁群QTL置信区间内。该标记可作为与A9位点QTL紧密连锁的分子标记，其序列如下所示：正向引物：5'-CGATTAAAGGCTTGGTTTCG-3'(与序列表SEQIDNO：1序列相同)反向引物：5'-CCGTTCTGCTTCAAATCTCC-3'(与序列表SEQIDNO：2序列相同)以该引物扩增，得到如序列表SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示核苷酸序列。该引物可作为共显性分子标记在油菜标记辅助选择中应用，能够区分(筛选)甘蓝型油菜A9位点高油酸与低油酸材料。本专利技术的积极效果：(1)本专利技术中发现的位于甘蓝型油菜A9连锁群上控制种子中油酸含量的QTL位点，是一个不同于现有报道中控制油酸含量的新的位点。将该位点引入到现有的普通油菜品种，可以提高油酸含量3-5％，有助于解决现有高油酸育种中基因资源单一的问题。(2)本专利技术开发了针对上述位点的特异分子标记。该标记能够有效地用于在油菜生长发育早期鉴定高油酸基因型，可以克服传统育种方法中仅仅依靠表型选择需要收获成熟种子、以及种子发育中受环境条件影响，从而影响鉴定准确性的问题。(3)利用本专利技术制备的分子标记(或称分子标记引物)可进行油菜油酸性状的分子标记辅助选择(例如中作为精细定位和图位克隆中的应用)，以及用于该QTL对应基因的克隆，可以明显减少育种工作量，缩短育种年限，加快油菜育种和分离基因的进程。附图说明序列表SEQIDNO：1是本专利技术筛选的引物组合BnA129的正向引物序列。序列表SEQIDNO：2是本专利技术筛选的引物组合BnA129的反向引物序列。序列表SEQIDNO：3是本专利技术筛选的分子标记引物对A基因型扩增产物的核苷酸序列，序列长度为100bp；序列表中SEQIDNO：4是本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个控制甘蓝型油菜中油酸含量的QTL位点OLEA9紧密连锁的共显性分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3或/和SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一个控制甘蓝型油菜中油酸含量的QTL位点OLEA9紧密连锁的共显性分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：3或/和SEQIDNO：4所示。2.扩增如权利要求1所述的共显性分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：正向引物：CCGTTCTGCTTCAAATCTCC，反向引物：CGATTAAAGGCTTGGTTTCG。3.一种筛选与甘蓝型油菜油酸含量QTL紧密连锁的分子标记的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：a)以甘蓝型油菜品系ZP1与甘蓝型油菜品系甲A254杂交，得到杂种F1；b)将杂种F1的花蕾通过小孢子培养获得分离的DH系群体；c)分离DH系群体每一个株系的基因组DNA，采用SSR、InDel引物进行PCR扩增，获得每个株系的基因型，对DH系群体的每一个株系进行分子标记分析，并对每个株系的基因型进行描述；d)用获得的分子标记信息构建甘蓝型油菜遗传连锁图；e)测定DH群体中每个系成熟种子的油酸含量；f)将DH群体每个株系的油酸含量与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，以2.5为LOD阈值，将大于2.5界定为一个QTL位点；g)在A5连锁群和A9连锁群中鉴定筛选出到两个稳定的QTL，其中在A9连锁群上QTL位点的QTL为OLEA9；h)选择仅含A9位点油酸含量为...

【专利技术属性】
技术研发人员：周永明，赵青，吴建，蔡光勤，杨庆勇，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42