【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及果实硬度的分子标记，尤其涉及甜樱桃果实硬度的aflp分子标记、检测引物及其应用，属于甜樱桃果实硬度的分子标记、检测引物及其应用领域。
技术介绍
1、甜樱桃(prunus avium l.)是蔷薇科李属樱桃亚属植物，是目前北方落叶果树中栽培效益较好且上市最早的鲜果，具有较高的营养价值和保健功效，深受消费者喜爱。果实硬度是甜樱桃最主要的品质属性之一，甜樱桃果实成熟后容易软化，品质下降明显，成为制约甜樱桃果实贮藏寿命和货架期的重要因素，严重限制了甜樱桃产业的发展。目前，与甜樱桃果实硬度相关的基因研究较少，控制甜樱桃果实硬度的关键机制仍不清楚。因此，开展控制甜樱桃果实硬度相关基因或分子标记的挖掘及机理解析工作，对提高甜樱桃果实综合品质，增强市场竞争力以及选育和培育硬质型的甜樱桃新品种具有重要的实践意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一是提供甜樱桃果实硬度aflp分子标记；
2、本专利技术的目的之二是提供用于甜樱桃果实硬度的aflp分子标记检测引物；
3、本专利技术的目的之三将所述的甜樱桃果实硬度的分子标记或其检测引物应用于检测甜樱桃果实的硬度或选育和培育硬质型甜樱桃新品种。
4、本专利技术的一方面是提供了核苷酸序列为seq id no.1所示的转座子插入片段作为甜樱桃果实硬度的aflp分子标记。
5、本专利技术为了确定pav_sc0000480.1_g920.1.mk是否为控制甜樱桃果实硬度的候选基因，考虑到pav_sc
6、本专利技术进一步根据pavscpl基因(5.2kb te插入)的dna多态性，设计了与甜樱桃果实硬度表型相关的扩增片段长度多态性(aflp)标记pavscpl-1-f/r(seq id no.3和seq idno.4)、pavscpl-2-life-f/r(seq id no.5和seq id no.6)和pavscpl-3-right-f/r(seqid no.7和seq id no.8)，用于检测部分自然群体和杂交群体中果实硬度性状与基因型的共分离情况；利用aflp标记pavscpl-1-f/r检测发现，硬质型甜樱桃果实只扩增出1条大片段条带，暗示硬质型中pavscpl基因型为5.2kb的转座子的纯合插入；硬肉型果实扩增出2条带(一条大片段和一条小片段)，暗示硬肉型中pavscpl基因型为杂合插入；软肉型甜樱桃果实中仅扩增出1条短片段，暗示软肉型中pavscpl不存在5.2kb的转座子插入。进一步利用aflp标记pavscpl-2-life-f/r和pavscpl-3-right-f/r检测，发现类似的鉴定结果，即硬肉型和硬质型均可扩增出5.2kb的转座子插入片段，而软肉型中无法扩增出5.2kb的转座子插入片段。因此，采用本专利技术提供的pavscpl基因相关的aflp标记检测结果的准确率达100％，pavscpl基因及等位基因鉴定的甜樱桃果实硬度性状结果与硬度表型结果一致，表明pavscpl基因的基因型与果实硬度表型共分离。
7、本专利技术的另一方面提供了应用核苷酸序列为seq id no.1所示的转座子插入片段检测甜樱桃果实硬度或选育、培育硬质型甜樱桃品种中的应用，包括：(1)以核苷酸序列为seq id no.1所示的转座子插入片段为靶标基因设计aflp标记引物；(2)以待检测甜樱桃样品的dna为模板dna，以aflp标记引物为扩增引物建立pcr扩增体系进行pcr扩增；(3)如果扩增产物中扩增出seq id no.1所示的转座子插入片段，则待检测的甜樱桃的果实为硬肉型或硬质型；如果扩增产物中没有扩增出seq id no.1所示的转座子插入片段，，则待检测的甜樱桃的果实为软肉型。
8、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的pcr反应扩增体系如下：kod one tmpcr master mix 12.5μl，正向引物0.75μl，反向引物0.75μl，ddh2o 9μl，dna 2μl，总体系25μl。
9、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的pcr扩增的程序如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸1或3min，32个扩增循环；72℃延伸10min。
10、作为本专利技术的一种优选的具体实施方案，本专利技术以核苷酸序列为seq id no.1所示的转座子插入片段为靶标基因设计得到了3对aflp标记引物，即：pavscpl-1-f/r、pavscpl-2-life-f/r和pavscpl-3-right-f/r；其中，aflp标记引物pavscpl-1-f/r的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为seq id no.3和seq id no.4所示，aflp标记引物pavscpl-2-life-f/r的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为seq idno.5和seq idno.6所示，aflp标记引物pavscpl-3-right-f/r的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为seq id no.7和seq id no.8所示。
11、本专利技术进一步提供了一种检测甜樱桃果实硬度的pcr检测试剂盒，包括：kod onetm pcr master mix 12.5μl，正向引物、反向引物和ddh2o；其中，所述的正向引物和反向引物分别选自以下三对aflp标记引物对中的任何一对：(1)aflp标记引物pavscpl-1-f/r，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为seq id no.3和seq id no.4所示；(2)aflp标记引物pavscpl-2-life-f/r，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为seq id no.5和seqid no.6所示；(3)aflp标记引物pavscpl-3-right-f/r，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为seq idno.7和seq id no.8所示。
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1.核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的转座子插入片段作为甜樱桃果实硬度的AFLP分子标记的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：(1)以核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的转座子插入片段为靶标基因设计AFLP分子标记引物；(2)以待检测甜樱桃样品的DNA为模板DNA，以AFLP分子标记引物为扩增引物建立PCR扩增体系进行PCR扩增；(3)如果扩增产物中扩增出SEQ ID No.1所示的转座子插入片段，则待检测的甜樱桃的果实为硬肉型或硬质型果实；如果扩增产物中没有扩增出SEQ ID No.1所示的转座子插入片段，则待检测的甜樱桃的果实为软肉型果实。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的PCR反应扩增体系如下：KOD One TMPCR Master Mix 12.5μL，正向引物0.75μL，反向引物0.75μL，ddH2O 9μL，DNA 2μL，总体系25μL。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增的程序如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸1或
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述软肉型果实是指甜樱桃果实硬度为0-3.5Kg/cm2；所述的硬肉型果实是指甜樱桃果实的硬度为3.5-6.5Kg/cm2；所述的硬质型果实是指甜樱桃果实的硬度为6.5Kg/cm2以上。
6.用于检测为甜樱桃果实硬度的AFLP分子标记检测引物，其特征在于，所述的AFLP分子标记检测引物选自以下三组引物中的任何一种：PavSCPL-1-F/R、PavSCPL-2-life-F/R和PavSCPL-3-right-F/R；其中，AFLP分子标记检测引物PavSCPL-1-F/R的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述AFLP分子标记检测引物PavSCPL-2-life-F/R的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNo.5和SEQ IDNo.6所示，所述AFLP分子标记检测引物PavSCPL-3-right-F/R的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示。
7.权利要求6所述的AFLP分子标记检测引物在检测甜樱桃果实硬度或选育、培育硬质型甜樱桃品种中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括：(1)以待检测甜樱桃样品的DNA为模板DNA，以所述的AFLP分子标记检测引物为扩增引物建立PCR扩增体系进行PCR扩增；(2)如果扩增产物中扩增出核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的转座子插入片段，则待检测的甜樱桃的果实为硬肉型或硬质型果实；如果扩增产物中没有扩增出核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的转座子插入片段，则待检测的甜樱桃的果实为软肉型果实。
9.一种检测甜樱桃果实硬度的PCR检测试剂盒，包括：KOD One TM PCR Master Mix12.5μL，正向引物、反向引物和ddH2O；其特征在于，所述的正向引物和反向引物分别选自以下三对AFLP分子标记检测引物对中的任何一对：(1)AFLP分子标记检测引物PavSCPL-1-F/R，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；(2)AFLP分子标记检测引物PavSCPL-2-life-F/R，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为SEQID No.5和SEQ ID No.6所示；(3)AFLP分子标记检测引物PavSCPL-3-right-F/R，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
10.权利要求9所述的PCR检测试剂盒在检测甜樱桃果实硬度或选育、培育硬质型甜樱桃品种中的应用。
...【技术特征摘要】
1.核苷酸序列为seq id no.1所示的转座子插入片段作为甜樱桃果实硬度的aflp分子标记的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：(1)以核苷酸序列为seq id no.1所示的转座子插入片段为靶标基因设计aflp分子标记引物；(2)以待检测甜樱桃样品的dna为模板dna，以aflp分子标记引物为扩增引物建立pcr扩增体系进行pcr扩增；(3)如果扩增产物中扩增出seq id no.1所示的转座子插入片段，则待检测的甜樱桃的果实为硬肉型或硬质型果实；如果扩增产物中没有扩增出seq id no.1所示的转座子插入片段，则待检测的甜樱桃的果实为软肉型果实。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的pcr反应扩增体系如下：kod one tmpcr master mix 12.5μl，正向引物0.75μl，反向引物0.75μl，ddh2o 9μl，dna 2μl，总体系25μl。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的pcr扩增的程序如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸1或3min，32个扩增循环；72℃延伸10min。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述软肉型果实是指甜樱桃果实硬度为0-3.5kg/cm2；所述的硬肉型果实是指甜樱桃果实的硬度为3.5-6.5kg/cm2；所述的硬质型果实是指甜樱桃果实的硬度为6.5kg/cm2以上。
6.用于检测为甜樱桃果实硬度的aflp分子标记检测引物，其特征在于，所述的aflp分子标记检测引物选自以下三组引物中的任何一种：pavscpl-1-f/r、pavscpl-2-life-f/r和pavscpl-3-right-f/r；其中，aflp分子标记检测引物pavscpl-1-f/r的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为seq id no.3和seq id no.4所示...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐希梁，李明，刘聪利，董媛鑫，宋露露，陈雷，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：
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