利用微生物发酵产生油脂的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用微生物发酵产生油脂的方法，该方法包括如下步骤：对产油微生物的种子液进行发酵培养，至对数生长期时投加表面活性剂，继续培养至稳定期，得到发酵液；离心发酵液，分别收集上清液和沉淀物；从上清液中提取出油脂，以及破碎沉淀物并提取油脂。本发明专利技术的产油微生物以乙酸作为碳源，并通过添加表面活性剂促进产油微生物从细胞内分泌油脂到细胞外的方法，提高了细胞外油脂产量及总的油脂产量，同时简化了油脂提取过程，不仅降低了微生物油脂的生产成本，而且还减少了微生物油脂提取过程中的能量消耗，为其规模化生产提供新的途径，具有较大的应用前景。

The method of producing oil by microorganism fermentation

The invention provides a method for producing oil by microorganism fermentation. The method comprises the following steps: fermentation and culture of seed liquid of the oil producing microorganism, adding surfactants to the logarithmic growth period, continuing to be cultured to the stable period, obtaining the fermentation liquid, and collecting the supernatant and sediment respectively. The supernatant was extracted from the oil, and the broken sediment and oil were extracted. The oil producing microorganism of the invention uses acetic acid as the carbon source, and improves the output of oil and fat and the total oil production by adding the surfactant to promote the oil producing microorganism from the cell endocrine oil to the cell, and simplifies the process of oil extraction, which not only reduces the production cost of the microbial oil, but also reduces the production cost of the microbial oil, but also the production cost of the microbial oil is also reduced. It reduces the energy consumption in the process of microbial oil extraction, and provides a new way for its large-scale production. It has great application prospects.

【技术实现步骤摘要】
利用微生物发酵产生油脂的方法
本专利技术属于微生物油脂合成
，具体涉及一种利用微生物发酵产生油脂的方法。
技术介绍
生物柴油因其具有可再生性、能量密度高和易生物降解等优势，被认为是化石柴油的潜在替代品，而微生物油脂可以用作生物柴油的生产原料，替代植物油脂(大豆、玉米)和动物油脂等油脂。微生物油脂的生产过程主要包括微生物的培养和油脂提取，前期的微生物培养过程主要受碳源价格限制造成培养成本增加，后期的油脂提取过程的消耗约占生物柴油生产总成本的40％。研究发现在产油酵母菌的细胞被破坏后加入高浓度的非离子型表面活性剂(TritonX‐100、Brij58)等可促进真菌分泌脂肪酸至胞外(Tamano,K.，Miura,A.，Koike,H.High‐efficiencyextracellularreleaseoffreefattyacidsfromAspergillusoryzaeusingnon‐ionicsurfactants.J.Biotechnol,2017,248,9‐14)。近年来有学者通过基因改造的方式促进产油酵母菌分泌细胞外游离脂肪酸，也有主要通过改变培养条件促进酵母菌利用有机碳源合成油脂，如采用序批式培养方式、提高培养基的C/N以及调节培养基的pH值等。另外，也有研究者发现通过加入阴离子型表面活性剂，如油酸钾和硬脂酸钠，可提高酵母菌胞内油脂含量。因此，寻求一种高效且低能耗的微生物油脂的生产方式具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中微生物油脂提取过程能耗大和成本高的不足，目的是提供一种利用微生物发酵产生油脂的方法。为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：一种利用微生物发酵产生油脂的方法，其包括如下步骤：(1)、对产油微生物的种子液进行发酵培养，至对数生长期(OD600≈10‐12)时投加表面活性剂，继续培养至稳定期，得到发酵液；(2)、离心发酵液，分别收集上清液和沉淀物；(3)、从上清液中提取出油脂，以及破碎沉淀物并提取油脂。在步骤(1)中，表面活性剂为聚氧乙烯醚(Brij58)，投加量为0.1‐1.0g/L。在步骤(1)中，产油微生物为能够利用乙酸产油脂的酵母菌。步骤(1)中的发酵培养包括：将经过第一培养基的产油微生物的种子液以体积比5‐10％接种至第二培养基中进行发酵培养。其中，第一培养基(即YPD培养基)包括如下成分：1±0.2g葡萄糖、0.5±0.3g鱼粉蛋白胨和0.5±0.3g酵母提取物。第二培养基为液体培养基；液体培养基包括：20±10g/L乙酸、0.5827±0.0005g/L酵母提取物、0.0777±0.0002g/L硫酸铵、0.4±0.1g/L磷酸二氢钾和1.5±0.3g/L七水硫酸镁。实际上，液体培养基的转速为150‐200rpm。液体培养基中初始pH值为7.0±0.5，温度为29.5‐30.5℃；碳氮比(C/N)为(100±15):1。在步骤(2)中，离心力为4000±200×g，离心的时间为5±10min。在步骤(3)中，沉淀物中油脂的提取过程为：离心后收集沉淀物，并用生理盐水进行清洗；破碎沉淀物中的微生物细胞，并结合有机溶剂萃取从而提取出油脂。在步骤(3)中，上清液中油脂的提取的过程为：将上清液用有机溶剂萃取后得到下层液；用0.15±0.5wt％的氯化钠溶液对下层液进行清洗，氮吹得到油脂。其中，有机溶剂为甲醇、氯仿以体积比1:1‐1:1.5的混合液。在步骤(3)中，油脂包括油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸。由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：第一、本专利技术采用乙酸作为发酵培养基的碳源，其与以葡萄糖等糖类物质作为碳源相比，不仅降低了发酵培养过程中的碳源成本，而且还提高了碳源的转化率和油脂的含量，从而解决了产油微生物的培养过程中由于碳源价格受到限制的问题。第二、本专利技术在发酵培养过程中添加表面活性剂进行油脂提取的方法，相比与目前的油脂提取方法(物理破碎和有机溶剂萃取相结合)，其能量输入较小，不仅简化了油脂提取过程，而且还降低了微生物油脂的提取成本，为未来微生物油脂的规模化生产提供可能性。总之，本专利技术的产油微生物以乙酸作为碳源，并通过添加表面活性剂促进产油微生物从细胞内分泌油脂到细胞外的方法，提高了细胞外油脂产量及总的油脂产量，同时简化了油脂提取过程，不仅降低了微生物油脂的生产成本，而且还减少了微生物油脂提取过程中的能量消耗，为其规模化生产提供新的途径，具有较大的应用前景。附图说明图1为本专利技术的实施例和对比例中酵母菌在发酵培养过程中添加不同浓度的表面活性剂的胞内油脂产量、胞外油脂产量和油脂含量的示意图。图2为本专利技术的实施例和对比例中酵母菌在发酵培养过程中添加不同浓度的表面活性剂的碳源转化率和油脂总产量的示意图。具体实施方式本专利技术提供了一种利用微生物发酵产生油脂的方法。本专利技术的实施例和对比例中的产油微生物均采用能够利用乙酸产油脂的酵母菌，具体为CryptococcuscurvatusMUCL29819，购买于日本技术与评估国家研究所生物资源中心(BiologicalResourceCenter,NationalInstituteofTechnologyandEvaluation,Tokyo,Japan)。本专利技术的实施例和对比例中的酵母菌的种子培养过程为：将保藏的酵母菌的菌种在麦芽汁琼脂平板上活化后接种至50mL的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(即：YPD培养基)内，并在250mL锥形瓶中富集培养36h，培养温度为30℃，转速为200rpm。其中，YPD培养基中含有1g葡萄糖、0.5g鱼粉蛋白胨和0.5g酵母提取物(YE)，初始pH值为6.0。本专利技术的实施例和对比例的发酵培养过程中液体培养基为：液体培养基含有20g/L乙酸、0.5827g/L酵母提取物(YE)、0.0777g/L硫酸铵((NH4)2SO4)、0.4g/L磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.5g/L七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)，初始pH值为7.0。<利用微生物发酵产生油脂的方法>利用微生物发酵产生油脂的方法包括如下步骤：(1)、将产油微生物的菌种在第一培养基(即YPD培养基)中进行培养，得到产油微生物的种子液；(2)、将产油微生物的种子液接种至第二培养基(即液体培养基)中进行发酵培养，定期监测培养过程中产油微生物的生长情况；(3)、待发酵培养过程至对数生长期OD600≈10‐12(即发酵培养两天后)时，在液体培养基内投加表面活性剂继续培养至稳定期，即产油微生物不再生长时结束培养，得到发酵液；(4)、发酵培养结束后，离心发酵液并分别收集浑浊的上清液和沉淀物；(5)、从上清液中提取出油脂，以及破碎沉淀物并提取油脂。在步骤(2)中，产油微生物的种子液的体积比可以为5‐10％，优选为5％。其中，产油微生物的种子液的体积比即为在发酵培养过程中，产油微生物的种子液在液体培养基中所占的体积。产油微生物主要包括酵母菌、真菌和藻类为主的真核微生物及以细菌为主的原核微生物，本专利技术优选酵母菌作为产油微生物。实际上，酵母菌利用有机废弃物的水解产物如挥发性混合脂肪酸等积累的油脂进行培养，从而降低了培养成本。在步骤(2)中，产油微生物在发酵培养过程中，在氮磷限制条件下，可以利用碳水化合物、碳氢化合物和普通本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用微生物发酵产生油脂的方法，其特征在于：其包括如下步骤：(1)、对产油微生物的种子液进行发酵培养，至对数生长期时投加表面活性剂，继续培养至稳定期，得到发酵液；(2)、离心所述发酵液，收集上清液；(3)、从所述上清液中提取出油脂。

【技术特征摘要】
1.一种利用微生物发酵产生油脂的方法，其特征在于：其包括如下步骤：(1)、对产油微生物的种子液进行发酵培养，至对数生长期时投加表面活性剂，继续培养至稳定期，得到发酵液；(2)、离心所述发酵液，收集上清液；(3)、从所述上清液中提取出油脂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述表面活性剂为聚氧乙烯醚，投加量为0.1‐1.0g/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述产油微生物为能够利用乙酸产油脂的酵母菌。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中的发酵培养包括：将经过第一培养基的所述产油微生物的种子液以体积比5‐10％接种至第二培养基中进行发酵培养。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述第一培养基包括：1±0.2g葡萄糖、0.5±0.3g鱼粉蛋白胨和0.5±0.3g酵母提取物。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述第二培养基为液体培养基；优选地，所述液体培养基包括：20±10g/L乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄翔峰，刘佳，沈怡，罗会娟，穆天帅，陆丽君，彭开铭，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海,31