一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针及试剂盒。本发明专利技术RPA荧光定量引物对是针对HPV18病毒的基因组中的L1区域设计筛选获得的，能够特异性扩增HPV18，且扩增效果好。本发明专利技术检测方法为基于RPA技术的荧光定量检测方法，可用于特异性检测HPV18，该方法操作简便，灵敏度高，反应条件温和(37℃‑42℃)，反应时间短，结合便携式的荧光检测仪即可进行病原微生物的快速定量检测。本发明专利技术检测方法的灵敏度可以达到102拷贝。

【技术实现步骤摘要】
一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针及试剂盒
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针及试剂盒。
技术介绍
人类乳头状瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。流行病学和分子学研究证实了HPV感染是宫颈癌的病因。生殖道HPV感染是一种常见的性传播疾病。由于女性宫颈癌发生的主要原因是长期反复的高危型HPV感染，故HPVDNA的快速检测为预防和治疗宫颈癌的最有效手段之一。核酸扩增PCR技术由于其灵敏度高和特异性强等方面的优势，已经成为科学研究和临床研究中的一个基础和必要的技术手段。然而，PCR技术通常需要特制的仪器以及复杂的反应程序，成本高，耗时长，对于需要实时、现场、快速的非实验室环境检测及分析通常难以实现。近年来，基于模拟体内核酸复制、转录、修复机理发展起来的核酸体外等温扩增(Nucleicacidisothermalamplification，NCIA)技术的出现，解决了PCR技术上的局限，不仅简化了对仪器的要求，不需要昂贵的PCR仪，还缩短了反应时间，恒温条件下即可快速扩增出目标核酸片段。因其反应快速、灵敏度高、操作简便等优点而受到了多个领域的关注，尤其是体外诊断领域。目前，报道的NCIA技术有loop介导的体外恒温扩增(Loop-mediateisothermalamplification，LAMP)，核酸序列依赖扩增(Nucleicacidsequencebasedamplification，NASBA)，链置换扩增(Stranddisplacementamplification，SDA)，滚环扩增技术(rollingcircleamplification，RCA)。但这些恒温扩增技术在反应条件、反应试剂、反应时间、仪器设备以及操作简便性等方面存在较大的弊端。如LAMP对引物要求高，设计复杂，且产物结构复杂。NASBA通常扩增时间较长(约2-3小时)，需要抽提RNA，且当模板是DNA时需要高温变性处理。SDA需要反应前对模板进行热变性处理，才能引发带有核酸内切位点引物的配对。RCA需要设计一段锁式探针，通常在100bp左右，合成费用较高，并且在RCA反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA或者RNA可能产生一些背景信号。重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)能够在恒温条件下(37℃-42℃)实现对核酸的快速特异性扩增，且在20min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的可操作性，能够在非实验室条件下完成核酸检测，被称为是最具有可替代PCR潜力的核酸检测技术，且可以和琼脂糖凝胶检测、荧光检测技术结合实现实时、快速甚至定量检测。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供了一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针及试剂盒。一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对，包括上游引物和下游引物，序列为上游引物：5’-ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC-3’；下游引物：5’-ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT-3’。RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计，普通PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量探针，序列为：5’-GCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAG-3’，探针的其中两个核苷酸上连接有荧光基团和淬灭基团，且位于这两个核苷酸之间的某一个核苷酸为缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，为脱碱基位点；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。在RPA体系中引入一个带有荧光标记的探针，一方面可以提高RPA检测的特异性，另一方面还能实现对RPA扩增进行实时监控。探针长度通常在46-52bp之间，在探针上分别设计两个基团(一个荧光基团，一个淬灭基团)，两个基团之间设计一个脱碱基位点，该位点能被一核酸外切酶特异性识别，该酶具有3’-5’外切酶活性，可以使荧光基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。该酶只能特异性识别双链DNA，对单链DNA无活性，因而产生的荧光信号强度可与扩增产物同步增长。探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。优选的，所述的RPA荧光定量探针，序列为：5’-GCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATFGHATQAGCAGTATTTTAG-3’，其中TF表示连接有荧光基团的T，TQ表示连接有淬灭基团的T，H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。由于RPA荧光定量探针相对于普通荧光定量PCR探针来说，序列较长，如果将荧光基团和淬灭基团连接的两端，则效果相对于这样靠近设计来说，淬灭基团的对荧光基团的淬灭效果可能稍差。根据探针设计的常规要求，荧光基团不能连接到G上，因为G会淬灭荧光；而A与C连接荧光基团后，不如连接在T上稳定，所以选择将荧光基团连接到T上。优选的，所述荧光基团为FAM、TET、JOE、HEX或TAMRA，所述淬灭基团为BHQ。本专利技术对荧光基团和淬灭基团的选择并没有特殊性，常用的用于荧光定量PCR的荧光基团和淬灭基团均可使用。优选的，所述修饰基团为磷酸基。普通引物序列3’没有磷酸基团而是-OH，只有3’末端是-OH的片段才可以被聚合酶延伸，但3’修饰了磷酸基后，所得探针只能结合到模板上而不能扩增。本专利技术还公开了一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量试剂盒，包含所述的RPA荧光定量引物对和所述的RPA荧光定量探针。优选的，所述的RPA荧光定量试剂盒，包括核酸外切酶ExoⅢ。外切酶ExoⅢ可作用于平末端或3'凹陷末端双链DNA3'→5'外切酶活性。对单链DNA及3'突出末端双链DNA无活性。外切酶ExoⅢ也有RNaseH、3'磷酸酶和脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性。本专利技术就是基于外切酶ExoⅢ的脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性，即AP(Apurinic/apyrimidinic)位点内切酶活性功能设计。更优选的，所述核酸外切酶ExoⅢ的使用浓度为0.5～3U/μL。优选的，所述的RPA荧光定量试剂盒，包括试剂盒Liquidexo/exoRTQuickKit中的所有试剂。优选的，所述的RPA荧光定量试剂盒，包括浓度已知的标准品，所述标准品为包含如SEQIDNo.2所示序列的质粒。如SEQIDNo.2所示序列为上述引物对扩增HPV18的L1区域所获得的片段，大小为220bp。本专利技术还提供了一种特异性检测HPV18的方法，使用所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：(1)提取样本DNA作为模板；(2)分别使用所述RPA荧光定量引物对及RPA荧光定量探针对步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，序列为上游引物：5’‑ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC‑3’；下游引物：5’‑ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，序列为上游引物：5’-ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC-3’；下游引物：5’-ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT-3’。2.一种用于特异性检测HPV18的RPA荧光定量探针，其特征在于，序列为：5’-GCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAG-3’，探针的其中两个核苷酸上连接有荧光基团和淬灭基团，且位于这两个核苷酸之间的某一个核苷酸为缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，为脱碱基位点；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。3.如权利要求2所述的RPA荧光定量探针，其特征在于，序列为：5’-GCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATFGHATQAGCAGTATTTTAG-3’，其中TF表示连接有荧光基团的T，TQ表示连接有淬灭基团的T，H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。4.如权利要求2所述的RPA荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大龙，戴群莹，罗春华，胡小伟，韩斌，华绍炳，
申请(专利权)人：杭州德同生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33