一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系；所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针。本发明专利技术试剂盒利用聚合酶链式反应技术，能在较短的时间内定性检测人嗜T淋巴细胞病毒1型；灵敏度高，最低检出限为100 Copies/ml；特异性好，本发明专利技术根据gap区基因序列设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰，具有较高的特异性。本发明专利技术对于人嗜T淋巴细胞病毒1型的输血诊断与临床检测具有较高的参考价值，适于推广应用。

A kit for detection of human T lymphocyte virus type 1

The present invention discloses a kit for detecting human T lymphocyte virus type 1, including a reaction system consisting of a red cell lysate, a reaction liquid 1, a reaction liquid 2, a negative quality control product, and a positive quality control product. The reaction liquid 1 includes 2 specific primers designed according to the specificity of the human eosinophilic gap type gap region. 1 specific probes, 2 primers and 1 specific probes, were designed according to the specificity of human genome beta globin. By using polymerase chain reaction (PCR), the kit can detect human T lymphocyte virus type 1 in a short time. The sensitivity is high, the minimum detection limit is 100 Copies/ml, and the specificity is good. The invention designs 1 pairs of primers according to the gap region gene sequence, and has no cross interference with other pathogens, and has high specificity. . The invention has high reference value for blood transfusion diagnosis and clinical detection of human T lymphocyte virus type 1, and is suitable for popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，尤其是涉及一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒。
技术介绍
人嗜T淋巴细胞病毒1型与多种疾病有关，主要与成人T细胞白血病有密切关系，其传播途径主要是输血、性传播、静脉吸毒和家庭内传播，广泛分布与全世界，主要流行于日本西南部、加勒比海地区、非洲中部和中国东南沿海，严重威胁公共卫生安全。目前对人嗜T淋巴细胞病毒1型的检测主要采用传统的酶联免疫吸附法、明胶颗粒凝集法和间接荧光法，存在窗口期长、操作繁琐、假阳性和假阴性等问题。PCR技术由于其灵敏度高、特异性好和操作简便等优点，已经越来越广泛的应用于病毒检测，但目前尚未有将PCR技术应用于人嗜T淋巴细胞病毒1型检测方面。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种采用PCR技术检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系；所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针：引物1：5’-AGCCTTACCACACCTTCGTAG-3’（SEQIDNo.1）；引物2：5’-TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG-3’（SEQIDNo.2）；引物3：5’-TGGAACATATTTGACGGCTTT-3’（SEQIDNo.3）；引物4：5’-GATCTTAGCTACTACTGCCAA-3’（SEQIDNo.4）；探针1：FAM-ACGTAGCCCTTGACAACGGACT–BHQ1（SEQIDNo.5）；探针2：ROX-AAACCCACTGCATCACTCT–BHQ2（SEQIDNo.6）。所述反应液2中含有20~30mMMgCl2和0.09%叠氮化钠。所述阴性质控品中仅含人β珠蛋白基因质粒；所述阳性质控品中含有人嗜T淋巴细胞病毒1型RNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒。所述红细胞裂解液中包含0.1~0.2MNH4Cl，0.1~0.2mMEDTA和10~20mMNaHCO3。本专利技术的优点在于利用聚合酶链式反应技术，在50℃2min，94℃2min，（94℃5s，55℃30s）40循环扩增条件下，使用实时荧光定量PCR仪进行荧光检测，依据Ct值对人嗜T淋巴细胞病毒1型进行定性检测，使用内部对照（β珠蛋白）、阴性质控品和阳性质控品对检测结果进行监控。使用本专利技术试剂盒，能在较短的时间内定性检测人嗜T淋巴细胞病毒1型；灵敏度高，最低检出限为100Copies/ml；特异性好，本专利技术根据gap区基因序列设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰，具有较高的特异性。本专利技术对于人嗜T淋巴细胞病毒1型的输血诊断与临床检测具有较高的参考价值，适于推广应用。附图说明图1是采用本专利技术试剂盒对20份最低检出限样本进行检测的扩增曲线图。具体实施方式实施例1试剂盒反应体系（聚合酶链式反应）的准备：1、红细胞裂解液：H2O200ul，其中包含0.1~0.2MNH4Cl，0.1~0.2mMEDTA和10~20mMNaHCO3。2、反应液1：pH8.0的0.1MTris-HCl30ul，其中包括4pmol/µl引物1、4pmol/µl引物2、4pmol/µl引物3、4pmol/µl引物4、1pmol/µl探针1、1pmol/µl探针2、10UTaq酶、5UMMLV、0.1UUNG和10×PCR反应缓冲液，四条引物及两条探针分别为：引物1：5’-AGCCTTACCACACCTTCGTAG-3’（SEQIDNo.1）；引物2：5’-TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG-3’（SEQIDNo.2）；引物3：5’-TGGAACATATTTGACGGCTTT-3’（SEQIDNo.3）；引物4：5’-GATCTTAGCTACTACTGCCAA-3’（SEQIDNo.4）；探针1：FAM-ACGTAGCCCTTGACAACGGACT–BHQ1（SEQIDNo.5）；探针2：ROX-AAACCCACTGCATCACTCT–BHQ2（SEQIDNo.6）。3、反应液2：H2O10ul，其中包含20~30mMMgCl2和0.09%叠氮化钠。4、阴性质控品：TE50ul，含人β珠蛋白基因质粒，浓度为103Copies/ml。5、阳性质控品：TE50ul，含人嗜T淋巴细胞病毒1型RNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒，浓度均为103Copies/ml。实施例2用实施例1的反应体系按以下方法对人嗜T淋巴细胞病毒1型进行定性检测待测样品为含有100copies/ml人嗜T淋巴细胞病毒1型的人全血样本，当然，也可以为其他可能含有人嗜T淋巴细胞病毒1型的样本类型。1、全血前处理将全血样本与红细胞裂解液以1:3的体积比加入离心管中混合，上下颠倒混匀10次后，12000r/min离心5min；去上清，用1ml的生理盐水重悬沉淀。2、模板RNA提取（可使用商用提取试剂盒提取模板RNA，以备后续PCR反应使用，如可使用芯超生物--全血基因组DNA/RNA提取试剂盒）：1）添加10ul磁珠混悬液到上述处理后的待检样本中（磁珠混悬液的基础液是H2O，包含直径为0.5nm~1nm的超纯磁性氧化硅纳米磁珠）；2）再添加1ml裂解液到待检样本中，室温裂解3min（裂解液的基础液是H2O，包含3~5M的异硫氰酸胍和0.5%的Tween-20）；3）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；4）在上述离心管中添加2ml洗液A，吹打混匀（洗液A的基础液是H2O，包含1~3M的高氯酸钠，0.1~0.5M乙酸钾和25%的乙醇）；5）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；6）上述离心管中添加2ml洗液B，吹打混匀（洗液B的基础液是H2O，包含70~85%的乙醇）；7）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；8）在离心管中添加0.2ml洗脱液，吹打混匀（洗脱液：pH8.0TE）；9）70℃解离后靠磁取出上清液备用。3、聚合酶链式反应：在100µlPCR管配制反应体系：PCR反应液110µl，PCR反应液210µl，模板RNA20~50µl（阴阳性质控按照模板加样量直接添加），将上述反应管于50℃2min，94℃2min，（94℃5s，55℃30s）40循环扩增条件下反应。4、结果判定：阴性质控品应ROX显示Ct值≤40，FAM显示NoCt；阳性质控品应ROX显示Ct值≤40，FAM显示Ct值≤35。在以上2个条件下，仪器ROX显示Ct值≤40，FAM显示NoCt表示待检样品为阴性；仪器ROX显示Ct值≤40，FAM显示Ct值≤45表示待检样品为阴性。按照上述方法对20份最低检出限样本进行检测，得到的扩增曲线如图1所示，数据如表1所示：结论：采用本专利技术试剂盒对上述20例100Copies/ml的阳性临床样本进行检测，结果均为阳性，证明本专利技术试剂盒的检测限可以达到100Copies/ml。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，其特征在于：包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系；所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针：引物1：5’‑ AGCCTTACCACACCTTCGTAG ‑3’；引物2：5’‑ TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG ‑3’；引物3：5’‑ TGGAACATATTTGACGGCTTT ‑3’；引物4：5’‑ GATCTTAGCTACTACTGCCAA ‑3’；探针1：FAM‑ ACGTAGCCCTTGACAACGGACT –BHQ1；探针2：ROX‑ AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，其特征在于：包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系；所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针：引物1：5’-AGCCTTACCACACCTTCGTAG-3’；引物2：5’-TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG-3’；引物3：5’-TGGAACATATTTGACGGCTTT-3’；引物4：5’-GATCTTAGCTACTACTGCCAA-3’；探针1：FAM-ACGTAGCCCTTGACAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：安顺，李乾，王少鑫，李振红，杜美，鲁清月，付光宇，吴学炜，苗拥军，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41