B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法；该方法针对B型流感病毒HA基因基因保守区域设计了一组引物及两条探针SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示，两条探针选择不同的荧光标记，实现了一管反应体系中同时对两种型别的B型流感病毒进行鉴定，简化了疑似B型流感病毒感染病例的确诊流程。同时公开了待检样本的处理、荧光RT‑PCR反应体系及反应条件。本发明专利技术可以实现对我国大陆流行的B型流感病毒两种型鉴定，操作简单、应用方便，为呼吸道感染病原学和临床流行病学研究提供了可行的技术方法。

Primers and identification methods for typing of influenza B virus

The invention discloses a primer probe and identification method for typing B influenza virus typing. The method has designed a set of primers and two probes SEQ SEQ ID No.1 to SEQ ID No.4, which is designed for the HA gene gene of influenza virus, and the two probes select different fluorescent markers to realize the simultaneous pair in a tube reaction system. Two types of influenza B virus were identified to simplify the diagnosis process of suspected influenza B virus infection. At the same time, the processing of the samples to be inspected, the reaction system of RT PCR and reaction conditions were also disclosed. The invention can be used to identify the two types of influenza virus type B, which is popular in the mainland of China. It is easy to operate and is convenient for application. It provides a feasible technical method for the etiology and clinical epidemiology of respiratory infection.

【技术实现步骤摘要】
B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法
本专利技术属于生物
，涉及一种B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法。
技术介绍
流感是以一种由A型、B型或C型流感病毒引起的急性呼吸道疾病，呈季节性流行或局部暴发特征。流感病毒属于正粘病毒科，是一种单链负义RNA病毒，基因组分节段。其中A型流感病毒常引起世界范围内的流感大流行，而B型则是季节型流行趋势。与A型流感不同，人类是B型流感病毒的唯一宿主，B型流感病毒不分HA和NA亚型，而是划分为抗原不同的两个分支，即Victoria系和Yamagata系。每年B型流感病毒一个或两个分支，与季节性H1N1或季节性H3N2亚型流感病毒共流行，每年全球大概由8％的人感染流感病毒，约2％的人是由B型流感病毒感染引起的，发病率仅次于季节性H3N2亚型流感病毒。有研究报道结果显示，流感病毒感染引起的死亡中有29％是由B型流感病毒导致的。由于Real-timeRT-PCR(rRT-PCR)的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。通过rRT-PCR方法对流感病毒型别进行鉴定，能够在较短时间内对疑似感染样本进行确诊，该方法应用于临床标本检测时，可用于呼吸道病原监测以及临床流行病学研究。应用rRT-PCR方法对病毒核酸进行检测时，其难点之一在于在病毒的变异为引物和探针设计带来困难，为了准确对流行中的流感病毒进行鉴定，需要定期对流行毒株的序列进行比对和分析，如分型鉴定引物探针不再适用于流行的毒株，则需要对引物和探针序列进行更新。其二在于对不同的亚型或亚系进行鉴定的探针使用相同的荧光标记，同一检测反应体系中只能对一种亚型或亚系的流感病毒进行分型鉴定，如果需要对多个亚型或亚系进行分型鉴定，则需要更多的标本量，反应体系的配置和鉴定结果报告时间相应的增加。本专利技术选择在相对保守区域设计引物探针，选用特异性高的引物和Taqman探针，能够快速特异性地检测B型流感病毒，同时选用两种不同的荧光标记探针，优化了反应体系中引物和探针的浓度，避免了多重荧光反应体系中不同引物之间干扰，实现单次检测即可对两种亚系的B型流感病毒进行分型鉴定，进一步简化操作，节省检测时间。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提出一种操作简单、应用方便的B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：第一方面，本专利技术涉及一种rRT-PCR引物和探针组合，所述引物和探针包括长度为22～27bp的用于扩增B型流感病毒Victoria系和Yamagta系HA基因的寡核苷酸片段。优选的，所述rRT-PCR引物和探针组合包括针对B型流感病毒Victoria系的序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.2所示的引物对和序列如SEQIDNo.3所示的探针，以及针对B型流感病毒Yamagata系的序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.2所示的引物对和序列如SEQIDNo.4所示的探针。优选的，针对B型流感病毒Victoria系的探针两端的标记为FAM、BHQ1荧光素标记；针对B型流感病毒Yamagata系的探针两端的标记为HEX、BHQ1荧光素标记。具体如下：第一组引物和探针包括：引物名称引物序列(5’-3’)FluB-HA-F188(SEQIDNo.1)AGACCAGAGGGAAACTATGCCCFluB-HA-R270(SEQIDNo.2)TCCGGATGTAACAGGTCTGACTTFluB-HA-P-victoria(SEQIDNo.3)CAGACCAAAATGCACGGGGAAHATACC探针(SEQIDNo.3)两端分别为FAM和BHQ1标记。第二组引物和探针包括：引物名称引物序列(5’-3’)FluB-HA-F188(SEQIDNo.1)AGACCAGAGGGAAACTATGCCCFluB-HA-R270(SEQIDNo.2)TCCGGATGTAACAGGTCTGACTTFluB-HA-P-yamagata(SEQIDNo.4)CAGRCCAATGTGTGTGGGGAYCACACC探针(SEQIDNo.4)两端分别为HEX和BHQ1标记。第二方面，本专利技术涉及一种B型流感病毒分型鉴定用试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术所述的rRT-PCR引物和探针组合。优选的，所述试剂盒用于：鉴定或辅助鉴定待测病毒为B型流感病毒Victoria系或Yamagata系；或鉴定待测样本是否感染了B型流感病毒Victoria系或Yamagata系。第三方面，本专利技术涉及一种本专利技术所述的rRT-PCR引物和探针组合的应用，包括：鉴定或辅助鉴定待测病毒为B型流感病毒Victoria系或Yamagata系；或制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒为B型流感病毒Victoria系或Yamagata系的试剂盒；或鉴定待测样本是否感染了B型流感病毒Victoria系或Yamagata系；或制备用于鉴定待测样本是否感染了B型流感病毒Victoria系或Yamagata系的试剂盒。第四方面，本专利技术涉及一种非诊断目的的应用本专利技术所述的rRT-PCR引物和探针组合进行B型流感病毒分型鉴定的方法，所述方法包括如下步骤：S1、利用核酸提取试剂从待测流感病毒样本中提取RNA；S2、加入所述引物和探针组合进行一步法rRT-PCR核酸扩增反应；S3、根据Ct值判断是否是B型流感病毒核酸阳性，并根据阳性结果荧光标记的不同判断是Victoria系还是Yamagata系。优选的，步骤S3中，Ct值小于38的判断为阳性。优选的，步骤S3中，FAM通道阳性的可判断分型结果为B型流感病毒Victoria系；HEX通道阳性的可判断分型结果为B型流感病毒Yamagata系。即FAM标记阳性时表示B型流感病毒victoria系阳性，若HEX标记阳性时则表示B型流感病毒yamagata系阳性。优选的，所述一步法rRT-PCR核酸扩增反应的反应条件为：45℃，10分钟，1个循环；95℃，2分钟，1个循环；95℃，5秒，60℃，20秒，40个循环。本专利技术针对B型流感病毒Victoria系和Yamagata系HA基因保守区域设计了2条引物序列，如SEQIDNo.1～SEQIDNo.2所示，针对Victoria系和Yamagata系HA基因分别设计了两条Taqman探针，并在采用不同的应该光标记，简化了后续的分型鉴定步骤。同时公开了待检样本的处理、rRT-PCR反应体系及反应条件及结果判定标准。本专利技术可以实现对我国大陆流行的B型流感病毒的检测及分型鉴定,操作简单、应用方便，为呼吸道感染病原学和临床流行病学研究提供了可行的技术方法。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：本专利技术所述的B型流感病毒rRT-PCR引物位于B型流感病毒两个亚系Victoria系和Yamagata系HA基因的相对保守区域，两个亚系应用相同的引物，而Taqman探针则设计为亚系特异性，即Victoria系和Yamagata系分别应用不同的Taqman探针。同时为了简化检测步骤，减少反应体系配置，两条探针选择不同的荧光标记，因此可在同一管检测反应体系中实现对两种亚系B型流感病毒的分型鉴定。本专利技术所述的测序方法操作简单，应用方便。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种rRT‑PCR引物和探针组合，其特征在于，包括针对B型流感病毒Victoria系的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的引物对和序列如SEQ ID No.3所示的探针，以及针对B型流感病毒Yamagata系的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的引物对和序列如SEQ ID No.4所示的探针。

【技术特征摘要】
1.一种rRT-PCR引物和探针组合，其特征在于，包括针对B型流感病毒Victoria系的序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.2所示的引物对和序列如SEQIDNo.3所示的探针，以及针对B型流感病毒Yamagata系的序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.2所示的引物对和序列如SEQIDNo.4所示的探针。2.根据权利要求1所述的rRT-PCR引物和探针组合，其特征在于，针对B型流感病毒Victoria系的探针两端的标记为FAM、BHQ1荧光素标记；针对B型流感病毒Yamagata系的探针两端的标记为HEX、BHQ1荧光素标记。3.一种B型流感病毒分型鉴定用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的rRT-PCR引物和探针组合。4.如权利要求3所述的B型流感病毒分型鉴定用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于：鉴定或辅助鉴定待测病毒为B型流感病毒Victoria系或Yamagata系；或鉴定待测样本是否感染了B型流感病毒Victoria系或Yamagata系。5.一种如权利要求1或2所述的rRT-PCR引物和探针组合的应用，包括：鉴定或辅助鉴定待测病毒为B型流感病毒Victoria系或Yamagata系；或制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒为B型...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱兆奎，李晓丹，赵百慧，
申请(专利权)人：上海伯杰医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31