一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术的一种诺如病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法，包括诺如病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液，诺如病毒反应液为预分装至八连管中的冻干粉。其中，诺如病毒反应液中含有多条不同荧光标记的探针、引物、酶混合物、增强剂、冻干保护剂、10xbuffer、核苷酸混合物等，可以在同一反应体系中检测是否感染诺如病毒。通过内源性内参对样本采集、核酸提取、扩增和检测整个过程进行监控，避免因假阴性结果而导致的误判。探针为包括荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团空间位置上靠近报告基团从而抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5

【技术实现步骤摘要】
一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及诺如病毒核酸检测
，尤指一种诺如病毒核酸检测试剂 盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]诺如病毒(Norovirus，NV)是引起肠道急性病症的RNA病毒，根据RNA 多聚酶区核苷酸序列的相似性，将NV分为5个基因型(GI～GV)，其中只有 GI、GⅡ和GIV可以感染人。诺如病毒已被很多国家认为是导致成人和儿童病 毒性腹泻及肠胃炎的首要病原体，以手
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粪
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口为主，其次是直接接触传染，我 国流行的人类诺如病毒主要以基因组Ⅱ为主。感染临床表现为急性胃肠炎和渗 透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重 出现脱水症状。诺如病毒多在寒冷的冬季发病，所以又被称为冬季呕吐症。因 为其不能在细胞或组织中培养，对诊断工作带来了一定的困难。
[0003]经过检索，中国专利技术专利：腹泻病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应 用(申请号为201710503230.3，申请日为2017.06.27)，该申请案公开了一种 腹泻病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用。检测体系共有22对引物，其 中包括19对腹泻病原体、2对人基因组内参和1对系统质控内参引物。腹泻病 原体分别针对空肠弯曲菌、志贺菌、艰难梭菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、 肠产毒性大肠埃希菌、大肠埃希菌O157、弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、人星状 病毒、诺如病毒II、人肠道腺病毒、轮状病毒等。可在同一反应体系内直接对 粪便样本进行多种腹泻病原体的同步检测和分析，弥补了常规检测方法通量低、 耗时长和检出率低等缺点，第一时间为临床提供全面、精准、低成本的病原学 诊断，为个体化用药和精准医疗提供重要参考。但是该申请案针对多种引起腹 泻的病原体(包括细菌和病毒)进行检测，所用方法为毛细管电泳，通过引物 设计，不同的病原体可扩增不同长度的DNA片段，将扩增产物从PCR仪取出 后转移至毛细管电泳分析仪中分析扩增片段长度，不同长度DNA片段电泳速 度不同，从而区分不同的病原体。该申请案的不足之处：1.引物设计复杂，引 物合成成本较高。2.检测过程耗时较长，需先提取核酸，再PCR扩增，再毛 细管电泳分析片段长度进而分析可能感染的病原体。3.如若引物设计不够合理， 不同目的基因扩增片段长度相差过小，则会因为电泳中的漂移问题，无法有效 判断扩增片段的大小，进而带来检测误差。4.该方法仅包含诺如GⅡ型扩增引物， 因此无法检测其他型别的诺如病毒。而目前不管是从临床个性化诊治还是国家 疾控传染病监测需要，均需监测并区分常见患者所感染的诺如病毒型别。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方法，将针对检测诺如 GⅠ型和GⅡ型病毒检测并对其分型鉴定的效率慢、容易产生误差以及成本高的 的技术问题。
[0005]本专利技术提供的技术方案如下：一种诺如病毒核酸检测试剂盒，包括诺如病 毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。
[0006]优选地，所述诺如病毒反应液包括酶混合物、核苷酸混合液、10xBuffer、 增强剂、冻干保护剂、诺如病毒GⅠ上游引物、诺如病毒GⅠ下游引物、诺如病 毒GⅠ探针P1、诺如病毒GⅠ探针P2、诺如病毒GⅡ上游引物、诺如病毒GⅡ下 游引物、诺如病毒GⅡ探针、内参β
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actin上游引物、内参β
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actin下游引物和内 参β
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actin探针。
[0007]优选地，所述检测靶标位于诺如病毒GI型的VP1基因，所述检测靶标位 于诺如病毒GII型的ORF基因。
[0008]优选地，所述阳性对照液为诺如病毒病毒样颗粒、内参β
‑
actin病毒样颗粒 的混合液，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
[0009]优选地，所述诺如病毒GⅠ型上游引物的序列为GCTAGTGGCGCTGGTCA；
[0010]所述诺如病毒GⅠ型下游引物的序列为ATTAACTTGTCCAGCAGTCGC；
[0011]所述诺如病毒GⅠ探针P1的序列为：
[0012]AATGGATCCTGTAGCAGGTTCTTCGACA；
[0013]和/或；
[0014]所述所述诺如病毒GⅡ型上游引物的序列为：
[0015]TATGAGGAGGTGGCCATTG；
[0016]所述诺如病毒GⅡ型下游引物的序列为CCGGATCTTGGCCTCCT；
[0017]所述诺如病毒GⅡ型探针的序列为：
[0018]CAGGGCGACCGAGGAAGACTTCTGTGAAG。
[0019]优选地，所述诺如病毒GⅠ型上游引物序列中的第10位碱基G为锁核酸修 饰碱；
[0020]所述诺如病毒GⅠ型下游引物序列中的第15位碱基C为锁核酸修饰碱基；
[0021]所述诺如病毒GⅠ探针P1的序列中的第7为碱基T为修饰荧光基团，第18 位碱基G修饰淬灭基团，第28位A碱基为磷酸化碱基；
[0022]所述诺如病毒GⅠ探针P2的序列中的5
’
端修饰荧光基团，3
’
端修饰淬灭 基团；
[0023]和/或；
[0024]所述诺如病毒GⅡ型上游引物的序列中的第11位碱基T为锁核酸修饰碱 基；
[0025]所述诺如病毒GⅡ型下游引物的序列中的第7位碱基C为锁核酸修饰碱基；
[0026]所述诺如病毒GⅡ型探针序列中的5
’
端修饰荧光基团，第15位碱基A修饰 淬灭基团，第29位碱基G修饰淬灭基团。
[0027]优选地，所述诺如病毒GⅠ探针P1中所述T碱基修饰的荧光基团为FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、CY3、HEX中的一种；
[0028]所述诺如病毒GⅠ探针P1中G碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、 BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种；
[0029]所述诺如病毒GⅠ探针P2中5
’
端修饰的荧光基团与T碱基修饰的荧光基团 相同；所述诺如病毒GⅠ探针P2中3
’
端修饰的淬灭基团与G碱基修饰的荧光 淬灭基团相同。
[0030]优选地，所述诺如病毒GⅡ型探针的5
’
端修饰荧光基团可与GⅠ探针P1的 荧光基团相同时，所述试剂盒作为诺如病毒GI和GII通用型检测试剂盒；
[0031]所述诺如病毒GⅡ型探针的5
’
端修饰荧光基团与GⅠ探针P1的荧光基团不 同，所述试剂盒作为诺如病毒GI和GII分型检测试剂盒。
[0032]优选地，所述内参上游引物的序列为CTGGCACCACACCTTCTACAA；
[0033]所述内参下游引物的序列为AAACATGATCTGGGTCATCTTCT；
[0034]所述内参探针的序列为CCGTGCTGCTGACCGAGGCCC，其中，第6位碱基C修饰荧光基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：包括诺如病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。2.根据权利要求1所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述诺如病毒反应液包括酶混合物、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂、诺如病毒GⅠ上游引物、诺如病毒GⅠ下游引物、诺如病毒GⅠ探针P1、诺如病毒GⅠ探针P2、诺如病毒GⅡ上游引物、诺如病毒GⅡ下游引物、诺如病毒GⅡ探针、内参β
‑
actin上游引物、内参β
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actin下游引物和内参β
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actin探针。3.根据权利要求2所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述检测靶标位于诺如病毒GI型的VP1基因，所述检测靶标位于诺如病毒GII型的ORF基因。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液为诺如病毒病毒样颗粒、内参β
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actin病毒样颗粒的混合液，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。5.根据权利要求4所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述诺如病毒GⅠ型上游引物的序列为GCTAGTGGCGCTGGTCA；所述诺如病毒GⅠ型下游引物的序列为ATTAACTTGTCCAGCAGTCGC；所述诺如病毒GⅠ探针P1的序列为：AATGGATCCTGTAGCAGGTTCTTCGACA；和/或；所述所述诺如病毒GⅡ型上游引物的序列为：TATGAGGAGGTGGCCATTG；所述诺如病毒GⅡ型下游引物的序列为CCGGATCTTGGCCTCCT；所述诺如病毒GⅡ型探针的序列为：CAGGGCGACCGAGGAAGACTTCTGTGAAG。6.根据权利要求5所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述诺如病毒GⅠ型上游引物序列中的第10位碱基G为锁核酸修饰碱；所述诺如病毒GⅠ型下游引物序列中的第15位碱基C为锁核酸修饰碱基；所述诺如病毒GⅠ探针P1的序列中的第7为碱基T为修饰荧光基团，第18位碱基G修饰淬灭基团，第28位A碱基为磷酸化碱基；所述诺如病毒GⅠ探针P2的序列中的5
’
端修饰荧光基团，3
’
端修饰淬灭基团；和/或；所述诺如病毒GⅡ型上游引物的序列中的第11位碱基T为锁核酸修饰碱基；所述诺如病毒GⅡ型下游引物的序列中的第7位碱基C为锁核酸修饰碱基；所述诺如病毒GⅡ型探针序列中的5
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端修饰荧光基团，第15位碱基A修饰淬灭基团，第29位碱基G修饰淬灭基团。7.根据权利要求6所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述诺如病毒GⅠ探针P1中所述T碱基修饰的荧光基团为FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、CY3、HEX中的一种；所述诺如病毒GⅠ探针P1中G碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种；
所述诺如病毒GⅠ探针P2中5
’
端修饰的荧光基团与T碱基修饰的荧光基团相同；所述诺如病毒GⅠ探针P2中3
’
端修饰的淬灭基团与G碱基修饰的荧光淬灭基团相同。8.根据权利要求7所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述诺如病毒GⅡ型探针的5
’
端修饰荧光基团可与GⅠ探针P1的荧光基团相同时，所述试剂盒作为诺如病毒GI和GII通用型检测试剂盒；所述诺如病毒GⅡ型探针的5
’
端修饰荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵百慧，杨孙孝，李春明，王馨玉，
申请(专利权)人：上海伯杰医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：