一种快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测汉坦病毒SEOV

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及一种快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的试剂盒及其检测方法，属于分子生物学


技术介绍

[0002]汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，临床上可引起2种严重的急性传染性疾病，即肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合症。中国是受汉坦病毒危害最严重的国家，病例分布广泛，发病人数和死亡人数均居世界首位。其基因组为分节段的单股负链RNA，由S、M、L 3个RNA片段组成，每个基因片段都只有一个开放读码框。
[0003]汉坦病毒是在上个世纪50年代首次在朝鲜发现的，当时有3000多名联合国士兵患上了“朝鲜出血热”，即肾综合征出血热。该病1993年第二次爆发于美国四角地区，最初被称为四角病，现在被称为汉坦病毒肺综合征。汉坦病毒是一种人畜共患病病原体，以啮齿动物、蝙蝠、鼹鼠和地鼠等小型哺乳动物作为自然宿主和主要传染源，仅在阿根廷的安第斯病毒中证实了人与人之间的传播，它会通过宿主的排泄物或飞沫向人类传播，其感染传播的风险覆盖全球大多数国家和地区。据统计，在全世界每年登记的病例超过20万例，肾综合征出血热的病死率在0.1％
‑
15％之间，肾综合征出血热的病死率在20％
‑
40％之间，肾综合征出血热是由汉滩型、汉城型、普玛拉型和多不拉伐型等几种正汉坦病毒引起的，而无名病毒和纽约病毒与肺综合症出血热有关，其中肺综合症出血热多发于欧亚大陆，肾综合征出血热多发于美洲地区。在亚洲，主要流行的是汉滩型病毒和汉城型病毒，其中汉滩型型可分为9个亚型，汉城型则有4～6个亚型。
[0004]聚合酶链式反应是目前使用最为广泛的核酸扩增技术，但PCR技术在生产实践中，需要使用PCR仪、电泳仪等仪器才得以进行，并且在实验过程中需要对温度进行升降调节，这也使得该技术对PCR仪的依赖性较强，同时一个实验完成所需的时间较长，不够便捷快速且成本高，对现场的大规模快速检测和一些条件不充足的地区来说是比较不理想的一种方法，这是目前普通PCR技术所无法逾越的局限性，由于我国的汉坦病毒的危害肆虐严重，一些汉坦病毒的基因型或亚型缺乏快速诊断检测方法，这种局限性也导致了不能更加快速的确定人群感染亚型并进行病原体溯源，迫切需要建立相关亚型的特异性检测手段。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术提供一种酶切探针等温扩增技术快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的方法及其试剂盒，所述试剂盒包括：检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的等温扩增引物和相应可被RNaseH酶切的含RNA碱基探针；其中该碱基探针的RNA碱基左、右两端分别标记报告荧光基团和淬灭基团。本专利技术利用该技术针对汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的核酸保守区域设计了特异性的等温扩增引物和rProbe探针，结合耐高温的RNaseH，通过RNaseH可酶切DNA与RNA杂交链中的RNA的磷酸二酯键的特性，当待测样本中含有靶标核酸时，通过等温扩增出大量靶标DNA/cDNA，rProbe会与目标DNA/cDNA结合形成探针
‑
目标核酸杂交双链，再
通过RNaseH切割探针
‑
目标核酸杂交双链中的RNA碱基，使得RNA碱基及其右侧含有淬灭基团的探针片段游离出去，而在RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链且可作为引物继续延伸，同时荧光基团发出荧光，从而判定目标核酸的存在。其具体技术方案如下：
[0006]本专利技术快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的试剂盒，包括核酸反应液、检测酶液、阳性质控品和阴性对照品，
[0007]所述核酸反应液包括特异性酶切等温扩增引物、核糖核酸酶RNaseH、rProbe探针，所述核糖核酸酶RNaseH为耐热核糖核酸酶RNaseH，所述rProbe探针上包括一个RNA碱基，且rProbe探针两端的DNA碱基上分别标记有荧光基团和淬灭基团,
[0008]所述检测酶液包括Bst核酸聚合酶与AMV逆转录酶，
[0009]所述阳性质控品为汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的假病毒，阴性对照品为无RNA/DNA水。
[0010]进一步的，所述特异性酶切等温扩增引物的序列如SEQ ID NO.10
‑
SEQ ID NO.14，所述rProbe探针是可被RNaseH酶切的探针，其序列如SEQ ID NO.28。
[0011]进一步的，还包括内参对照品，该内参对照品为外源内参基因片段假病毒。
[0012]进一步的，所述内参对照品为一段人工合成且与汉城病毒SEOV
‑
S4亚型及人源核酸均非同源的内参基因等温扩增引物。
[0013]进一步的，所述等温扩增引物序列具体如如SEQ ID NO.24
‑
SEQ ID NO.26，所用的探针序列如SEQ ID NO.27。
[0014]进一步的，序列如SEQ ID NO.28的rProbe探针和序列如SEQ ID NO.27的探针分别由不同的荧光色标记。
[0015]进一步的，荧光基团为FAM，淬灭基团为CY5。
[0016]基于上述试剂盒进行快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的方法，包括以下步骤：
[0017]步骤1：试剂盒制备
[0018]假病毒的制备：将编码MS2噬菌体相应蛋白的cDNA序列连接到原核表达载体(PET
‑
42a)启动子下游，构建表达载体pNCCL(pET42
‑
CP)，然后把汉坦病毒SEOV
‑
S480
‑
39的cDNA序列构建于表达载体中的MS2噬菌体包膜蛋白基因序列下游，取50μl菌液加入到5ml的LB液体培养基中，于37℃，220rpm震荡培养3h到对数生长期，再向其中加入IPTG，使其终浓度为1mM，继续将其于37℃，200rpm孵育3h；然后收集细胞，加入0.5ml超声缓冲液，冰上超声：350W，停5s，超声5s，30个循环；随即于6000rpm转速离心10min，收集上清，得到假病毒溶液，使用RNA提取试剂盒提取具有耐RNase特性的内含外源RNA序列的病毒样颗粒待用；
[0019]阳性质控品的制备：将步骤1.1获得的假病毒溶液梯度稀释后，提取RNA，选择Tt值在15
‑
20的假病毒稀释度作为阳性质控品中假病毒溶液的浓度，将假病毒溶液与内参质粒混合，保持该混合溶液中假病毒溶液的终浓度与上述假病毒的稀释度一致，此混合溶液中内参质粒的终浓度为1000copies/μL，此混合溶液即为阳性质控品；
[0020]最后制备核酸反应液、检测酶液、阴性对照品和内参对照品，其中核酸反应液包括引物、探针、核糖核酸酶RNaseH、甜菜碱、dNTP、MgSO4以及buffer；检测酶液包括Bst聚合酶和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的试剂盒，其特征在于，包括核酸反应液、检测酶液、阳性质控品和阴性对照品，所述核酸反应液包括特异性酶切等温扩增引物、核糖核酸酶RNaseH、rProbe探针，所述核糖核酸酶RNaseH为耐热核糖核酸酶RNaseH，所述rProbe探针上包括一个RNA碱基，且rProbe探针两端的DNA碱基上分别标记有荧光基团和淬灭基团,所述检测酶液包括Bst核酸聚合酶与AMV逆转录酶，所述阳性质控品为汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的假病毒，阴性对照品为无RNA/DNA水。2.根据权利要求1所述的快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的试剂盒，其特征在于，所述特异性酶切等温扩增引物的序列如SEQ ID NO.10
‑
SEQ ID NO.14，所述rProbe探针是可被RNaseH酶切的探针，其序列如SEQ ID NO.28。3.根据权利要求1所述的快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的试剂盒，其特征在于，还包括内参对照品，该内参对照品为外源内参基因片段假病毒。4.根据权利要求3所述的快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的试剂盒，其特征在于，所述内参对照品为一段人工合成且与汉城病毒SEOV
‑
S4亚型及人源核酸均非同源的内参基因等温扩增引物。5.根据权利要求4所述的快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的试剂盒，其特征在于，所述等温扩增引物序列具体如如SEQ ID NO.24
‑
SEQ ID NO.26，所用的探针序列如SEQ ID NO.27。6.根据权利要求2或5所述的快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的试剂盒，其特征在于，序列如SEQ ID NO.28的rProbe探针和序列如SEQ ID NO.27的探针分别由不同的荧光色标记。7.根据权利要求1所述的快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的试剂盒，其特征在于，荧光基团为FAM，淬灭基团为CY5。8.基于上述任一权利要求所述的试剂盒进行快速检测汉坦病毒SEOV
‑
S4亚型的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：试剂盒制备假病毒的制备：将编码MS2噬菌体相应蛋白的cDNA序列连接到原核表达载体(PET
‑
42a)启动子下游，构建表达载体pNCCL(pET42
‑
CP)，然后把汉坦病毒SEOV<...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭伟龙，艾乐乐，韩一芳，王刚，杨庆贵，洪倩，陈琼，朱长强，
申请(专利权)人：中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：