一种快速检测蝙蝠腺病毒的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测蝙蝠腺病毒的试剂盒及其检测方法。该方法包括：针对蝙蝠腺病毒Advcxc6较为保守的small T

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测蝙蝠腺病毒的试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及一种快速检测蝙蝠腺病毒的试剂盒及其检测方法，属于分子生物学


技术介绍

[0002]近年来，蝙蝠被证实为多种重要人畜共患病毒的储存宿主，由于其具有食性复杂、飞行距离长、与人和家畜关系密切等特点，往往给人类的健康带来极大的威胁。我国学者研究揭示了我国约20％的蝠种携带腺病毒，由于蝠种和地域分布的差异，蝙蝠腺病毒呈现显著的遗传多样性。因此建立一种快速检测蝙蝠携带腺病毒的方法，为腺病毒疫情预测预警具有重要意义。
[0003]等温扩增核酸方法，也称恒温扩增核酸方法，是进入21世纪以来快速发展的一种核酸扩增方式。等温扩增技术基本都能在1小时内实现目标核酸的检出，有的甚至可以实现20min中内完成检测。目前，等温扩增结果的判定方式基本可以分为三大类：一是跑琼脂糖凝胶电泳，观察胶图；二是目测法观察反应管在扩增前后的浊度或者颜色变化；三是在反应液中引入荧光信号，在简易的可读取荧光信号的设备上进行扩增，读取荧光信号的变化。随着技术发展，第三类等温扩增结果的判定方式的产品在市面上得到越来越好的推广和应用。
[0004]酶切探针等温扩增技术(Enzymatic Probe Isothermal Amplification，EPIA)针对待测目标核酸保守区域设计特异性的等温扩增引物和rProbe探针，其中rProbe两端分别设计荧光基团和淬灭基团。利用DNA聚合酶活性扩增待测目标核酸序列，rProbe结合到相应的待测目标序列上，形成探针
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目标核酸杂交双链，通过RNaseH切割探针
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目标核酸杂交双链中的RNA碱基，使得RNA碱基及其右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去，而在RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链且可作为引物继续延伸，同时荧光基团发出荧光。通过是否有扩增信号，来指示靶标核酸的有无。
[0005]目前预防医学和临床上对蝙蝠腺病毒检测技术具有简便快速，灵敏度高，特异性好的需求，而现有技术都有其局限性，因此我们亟需开发出一种快速，准确且低成本的蝙蝠腺病毒检测技术。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种快速检测蝙蝠腺病毒的试剂盒及其检测方法，在等温扩增的基础上引入了一条含RNA碱基的探针(RNHP)与耐高温的RNaseH，针对腺病毒的核酸保守区域设计了特异性的等温扩增引物和rProbe探针，结合耐高温的RNaseH，利用RNaseH可酶切DNA与RNA杂交链中的RNA的磷酸二酯键的特性，当待测样本中含有靶标核酸时，通过等温扩增出大量靶标DNA/cDNA，rProbe会与目标DNA/cDNA结合形成探针
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目标核酸杂交双链，再通过RNaseH切割探针
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目标核酸杂交双链中的RNA碱基，使得RNA碱基及其右侧含有淬灭基团的探针片段游离出去，而在RNA碱基左侧的含有荧光基团的片
段仍然保持形成杂交链且可作为引物继续延伸，同时荧光基团发出荧光，从而判定目标核酸的存在。
[0007]本专利技术试剂盒是检测蝙蝠腺病毒small T
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antigen基因的酶切等温扩增检测试剂盒，将检测蝙蝠腺病毒核酸的引物探针搭配检测内参的引物探针形成二重实时环介导等温扩增过程，包括核酸反应液、检测酶液、阳性质控品和阴性对照品，
[0008]所述核酸反应液包括特异性酶切等温扩增引物、核糖核酸酶RNaseH、荧光探针RNHP，所述核糖核酸酶RNaseH为耐热核糖核酸酶RNaseH，所述荧光探针RNHP上包括一个RNA碱基，且荧光探针RNHP两端的碱基上分别标记有荧光基团和淬灭基团,
[0009]所述检测酶液包括Bst核酸聚合酶与AMV逆转录酶，
[0010]所述阳性质控品为外源内参基因片段的标准质粒和腺病毒假病毒cRNA，阴性对照品为无RNA/DNA水。
[0011]进一步的，所述环介导等温扩增引物设有六条，序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10以及SEQ ID NO：11，所用的荧光探针RNHP序列如SEQ ID NO：35。
[0012]进一步的，还包括内参对照品，该内参对照品为人类ACTB基因，所用的环介导等温扩增引物设有六条，序列分别如SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41，所用的荧光探针RNHP序列如SEQ ID NO：42。
[0013]进一步的，荧光探针RNHP长度为19bp，且序列如SEQ ID NO：35的RNHP探针和序列如SEQ ID NO：42的RNHP探针分别由不同的荧光标记，所述特异性等温扩增引物片段为18
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39bp；所述筛选的外源内参对照品的长度为20
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37bp。
[0014]进一步的，荧光基团为FAM和ROX。
[0015]本专利技术还包括将上述试剂盒进行快速检测蝙蝠腺病毒的方法，包括以下步骤：
[0016]步骤1：阳性质控品的制备
[0017]构建假病毒质粒：在靶标基因扩增序列加入酶切位点，通过T4酶将目的小片段连接插入到经过改造后具有假病毒诱导功能的载体PET42a
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MS2上，然后测序鉴定无误后，保菌备用；
[0018]制备假病毒：将上述带有目的片段的菌液取50μl加入到5ml的LB液体培养基中，于37℃转速200
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220rpm震荡培养2.5～3h到对数生长期；再向其中加入IPTG，使其终浓度为1mM，再将其置于37℃，转速200rpm孵育3～4h；孵育结束后收集细胞，加入0.5ml超声缓冲液，于冰上超声：350W，停5s，超声5s，30个循环，然后于转速6000rpm，离心10min，再收集上清，即为假病毒溶液，提取其RNA检测即为阳性质控品；
[0019]最后制备核酸反应液、检测酶液、阴性对照品和内参对照品，其中核酸反应液包括引物、探针、核糖核酸酶RNaseH、甜菜碱、dNTP、MgSO4以及buffer；检测酶液包括Bst聚合酶和AMV逆转录酶；阳性质控品为上述制备的假病毒，内参对照品为人类ACTB基因；阴性对照品为无RNA/DNA水；
[0020]步骤2：引物探针筛选
[0021]选择small T
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antigen为基因靶序列，位于蝙蝠腺病毒Advcxc6基因组序列的1829
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2307bp处，这段靶序列的大小为479bp，设计特异性的引物和荧光探针RNHP，其中体系中设有一组人类ACTB基因作为外源内参，以避免假阴性；
[0022]步骤3：二重实时等温扩增体系
[0023]腺病毒假病毒和内参使用的引物和探针进行二重实时等温扩增反应体系为30μL，反应程序为：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测蝙蝠腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测蝙蝠腺病毒small T
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antigen基因的酶切等温扩增检测试剂盒，将检测蝙蝠腺病毒核酸的引物探针搭配检测内参的引物探针形成二重实时环介导等温扩增过程，包括核酸反应液、检测酶液、阳性质控品和阴性对照品，所述核酸反应液包括特异性酶切等温扩增引物、核糖核酸酶RNaseH、荧光探针RNHP，所述核糖核酸酶RNaseH为耐热核糖核酸酶RNaseH，所述荧光探针RNHP上包括一个RNA碱基，且荧光探针RNHP两端的碱基上分别标记有荧光基团和淬灭基团,所述检测酶液包括Bst核酸聚合酶与AMV逆转录酶，所述阳性质控品为外源内参基因片段的标准质粒和腺病毒假病毒cRNA，阴性对照品为无RNA/DNA水。2.根据权利要求1所述的快速检测蝙蝠腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增引物设有六条，序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10以及SEQ ID NO：11，所用的荧光探针RNHP序列如SEQ ID NO：35。3.根据权利要求1所述的快速检测蝙蝠腺病毒的试剂盒，其特征在于，还包括内参对照品，该内参对照品为人类ACTB基因，所用的环介导等温扩增引物设有六条，序列分别如SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41，所用的荧光探针RNHP序列如SEQ ID NO：42。4.根据权利要求2或3所述的快速检测蝙蝠腺病毒的试剂盒，其特征在于，荧光探针RNHP长度为19bp，且序列如SEQ ID NO：35的RNHP探针和序列如SEQ ID NO：42的RNHP探针分别由不同的荧光标记，所述特异性等温扩增引物片段为18
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39bp；所述筛选的外源内参对照品的长度为20
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37bp。5.根据权利要求1所述的快速检测蝙蝠腺病毒的试剂盒，其特征在于，荧光基团为FAM和ROX。6.基于上述任一权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱长强，谭伟龙，艾乐乐，黄恩炯，贺骥，周东明，罗艺哲，
申请(专利权)人：中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：