检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物及其应用方法技术

本发明专利技术涉及用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，所述引物与猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在ＤＮＡ聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分。本发明专利技术的用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物灵敏度高、特异性强。本发明专利技术还提供一种猪生殖和呼吸综合症病毒的检测方法和一种猪生殖和呼吸综合症病毒的检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及猪感染病毒检测
，特别涉及一组检测猪生殖和呼吸综 合症病毒的引物及检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法。
技术介绍
猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)属于称为动脉病毒的包膜的正链RNA 病毒家族，该家族中的其它病毒为原型病毒、马动脉炎病毒(EAV)、乳酸脱氢 酶病毒(LDV)和猿出血热病毒(SHFV)。与冠形病毒和动脉病毒共有的显著 特征近来导致它们在新产生的序列中的定位，巢病毒、动脉病毒组成的四个成 员，基因组结构，复制策略和蛋白的氨基酸序列类似，它们在体内和体外感染 巨噬细胞的优先选择也相似。1987年美国的养猪业经受了对养猪业产生严重经济影响的一种不为人知的 传染性疾病。该疾病综合症在欧洲包括德国、比利时、荷兰、西班牙和英国均 有报道。该疾病特征在于生殖力衰退、呼吸疾病以及包括食欲不振、发呼吸困 难及轻微神经病学症状的各种临床症状。这种综合症的一个主要部分为生殖力 衰退，表现为早产、后期流产、初生小猪体弱、死胎、干瘪胎儿、下崽率下降 和延迟发情期的恢复。呼吸疾病的临床症状在3周龄以下的小猪中最明显，但 据报告存在于各个养殖阶段的猪中。受感染的小猪生长緩慢，皮毛粗糙，呼吸 窘迫及死亡率增加。用金标准(golden standard)分析检测PRRSV是一种合理的诊断方法，该 方法可以通过受纳细胞从临床样品中检测出分离林病毒。但是，由于猪肺泡巨 噬细胞作为PRRSV的受纳细胞需要从更适合的(无特异性病原的)的6-8周龄 猪中收获，所以为了检测PRRSV而进行的病毒学诊断是非常困难的。为寻找替 代物，报道了一种使用组织化学法和免疫荧光法检测组织中的PRRSV抗原，但 是这些方法非常耗时，并且灵敏度低。基于聚合酶链反应(PCR)的检测法由于能够实现特异性和灵敏性故已经发展为研究热点，例如，已经使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和巢式-PCR (nested-PCR)检测PRRSV的病毒RNA。并且设计了 一种多重PCR检测用于 鉴别北美和欧洲PRRSV分离抹。此外，还发展了一种用于鉴别和作为疫苗 PRRSV分离株的PCR-扩增产物的限制性片段多样性分析。同时，还报道了在自 然-感染和攻毒猪中对PRRSV定量的实时PCR (Real-time)方法。但是，为了 扩增、精制和检测扩增产物的复杂程序，所有这些基于PCR的检测方法都需要 高精密度仪器，所以都不适用于现场检测领域的情况或是发展中国家的原始实 验室中。并且这些方法不但繁瑣，而且因为低特异性和易交叉污染，往往结果 并不可靠，在临床上造成许多窗口期的病原被错检或漏检，很难作为一种临床 上的常规方法进行推广。因此，发展一种简便、高特异且灵敏的核酸4全测方法 对PRRSV的预防和控制工作显得尤为重要。综上所述，为了解决以上问题，需要发展一种具有理想的特异性和灵敏度 的筒单、快速、低成本的PRRSV检测法。
技术实现思路
本专利技术的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一组灵敏度高、特 异性强的检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物。本专利技术的另一个目的是提供一种灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作 简单的猪生殖和呼吸综合症病毒的检测方法。本专利技术的另一个目的在于基于现有技术的不足而提供一种灵敏度高、特异 性强、反应时间短、操作简单的猪生殖和呼吸综合症病毒的检测试剂盒。本专利技术提供一组用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，所述引物与猪 生殖和呼吸综合症病毒的核香酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA 聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苦酸序列的一部 分。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引 物，为如下列序列号1~序列号6所示的寡核苷酸，或者序列号1 序列号6所示的寡核芬酸的互补链，其中R和Y均为简并碱基，R=G+A, Y=C+T。_序列号 引物名称_序列5,-3，_1 F3 GCTCACTATGGGAGCAGTAG<table>table see original document page 6</column></row><table>上述序列号1 6的引物对应SEQ ID NO.l ~ SEQ ID N0.6的引物。本专利技术的用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒引物，灵敏度高、特异性强。6 条引物共识别8个区域，充分保证其特异性。其中F3和B3是外引物，在起始 扩增反应时起作用；FIP和BIP称为内引物，在整个扩增过程都起作用，是最关 键的一对引物，导致产生环状的茎环结构而无限扩增；FL和BL称为环状引物， 用于提高反应速率。本专利技术提供一种检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法，该方法用于检测样 本中是否存在猪生殖和呼吸综合症病毒，所述方法采用可以与猪生殖和呼吸综 合症病毒的核苷酸序列的一部分或其互补^f连互补、并能够在DNA聚合酶的作用 下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分的引物，通过 环介导等温扩增法，特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一 部分，确认是否存在有扩增产物。作为本专利技术的优选实施方式，本专利技术检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法 包括如下步骤(1) 准备检测样本；(2) 提取样本的总RNA;(3 )对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，得到cDNA;(4) 对步骤(3)的cDNA进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为 60 ~ 65 。C ，反应时间为10 ~ 60分钟；(5) 纟冬止反应；(6) 检测所述扩增引物。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法中， 所述步骤(3 )和步骤(4 )合并为步骤(31 ):对步骤(2)的RNA进行逆转录 反应，在同一个反应体系中立即对cDNA产物进行环介导的等温核酸扩增反应， 反应温度为60 ~ 65°C ，反应时间共为10 ~ 60分钟。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术4全测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法中，所述检测样本选自下列样本中的一种或者组合(1) 猪的肺、肝以及内脏合并器官样本；(2) 公猪精液；(3) 血清；或者(4) 细胞培养物。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法中， 所述步骤(6)所述的检测是通过选自扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测和 扩增产物化学发光的检测方法进行的。本专利技术提供的猪生殖和呼吸综合症病毒的检测方法，釆用的引物灵敏度高、 特异性强；采用的环介导等温扩增反应，反应时间短、操作简单。本专利技术还提供一种检测生物样品中猪生殖和呼吸综合症病毒的试剂盒，所 述试剂盒包含有引物，所述引物与猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷S吏序列的一 部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼 吸综合症病毒的核酸序列的一部分。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术的^r测生物样品中猪生殖和呼吸综合症 病毒的试剂盒包含有引物，所述引物为如下列序列号1~序列号6所示的寡核苷 酸，或者序列号1 序列号6所示的寡核苷酸的互补链，其中R和Y均为简并碱基，R:G+A，YOT。<table>table see original document page 7</column></row>&l本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，其特征在于，所述引物与猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在ＤＮＡ聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永长，李强，薛春宜，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]