本发明专利技术涉及特异性结合ＰＲＲＳＶ的多肽及其筛选方法，属动物病毒学领域。该多肽为Ｈｉｓ?Ｔｒｐ?Ｔｒｐ?Ｓｅｒ?Ｔｒｐ?Ｐｒｏ?Ｓｅｒ?Ｔｙｒ?Ｔｈｒ?Ｇｌｎ?Ｓｅｒ?Ｓｅｒ；本发明专利技术还提供该多肽筛选方法：获得纯病毒；采用噬菌体随机肽库筛选出能与ＰＲＳＳＶ有很高亲和力的噬菌体单克隆，并测序。检测各噬菌体单克隆对ＰＲＲＳＶ的抑制能力，选取能明显抑制ＰＲＲＳＶ复制的噬菌体单克隆，所含多肽就是目的多肽。所述多肽能应用于ＰＲＲＳＶ的检测；可以将该多肽用ＦＩＴＣ标记后用于检测ＰＲＲＳＶ。本发明专利技术筛选多肽的方法，周期短，操作简单，与制作单克隆抗体的方法相比，更为方便快捷；筛选到的多肽能用于检测ＰＲＲＳＶ，操作简单，具有高特异性和很高的灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽及通过筛选获得该 多肽的方法，属动物病毒学领域。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种 传染性疾病，其症状主要特点为怀孕母猪发生流产、早产、死胎或木乃伊胎等严重的繁殖障 碍，仔猪与育肥猪出现呼吸道症状。我国于1995年底暴发此病，目前此病已成为危害我国 养猪业的最主要疫病。人们对PRRSV结构蛋白及非结构蛋白的功能、病毒的致病机制、病毒 的持续感染机制、机体对病毒的免疫机制等进行了深入的研究。PRRSV感染猪体的巨噬细胞 系统，引起机体的细胞免疫功能低下，而体液免疫产生的高水平抗体不但不能中和病毒，在 一定程度上还加深了病毒的感染。本病尚无特效治疗药物，在临床上只能采取防止继发感 染和降温及补充能量与营养等辅助治疗。噬菌体展示技术是一种用于筛选功能性多肽的生物技术。Smith于1985年首次成 功将外源基因通过基因工程手段插入丝状噬菌体基因组中，使表达的外源肽或蛋白与噬菌 体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面，从而建立了噬菌体展示技术。用抗原去淘洗抗体或随 机多肽构成的噬菌体展示文库，根据抗原-抗体反应原理，可以将与抗原紧密结合的抗体 或多肽片段筛选出来。目前，利用多克隆抗体进行间接免疫荧光检测PRRSV，操作步骤繁琐，特异性不强， 灵敏度不高。
技术实现思路
本专利技术提供一种能特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽、筛选该多肽的方 法和该多肽的应用。本专利技术提供一种能与猪繁殖与呼吸综合症病毒特异性结合的多肽，其氨基酸序列 如下His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser本专利技术还提供所述特异性结合多肽的筛选方法，包括如下步骤(1)纯化PRRSV获得纯病毒；然后进行噬菌体随机肽库筛选，通过三轮筛选富集能 与PRRSV特异性结合的噬菌体。(2)将第三轮筛选产物稀释后铺平皿，挑取各噬菌体单克隆进行ELISA鉴定，筛选 出能与rassv有很高的亲和力的噬菌体单克隆，并测出噬菌体单克隆的序列。(3)检测由步骤(2)所得各序列的噬菌体单克隆对PRRSV的抑制能力，选取能明显 抑制PRRSV复制的噬菌体单克隆，展示于该噬菌体单克隆表面的多肽即为能与特异性结合 猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的多肽。所述的多肽在猪繁殖与呼吸综合症病毒检测中的应用，优选方案是，将所述多肽 采用FITC进行标记，然后应用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的检测。综上所述，本专利技术通过筛选噬菌体随机12肽库，得到能特异性结合猪繁殖与呼吸 综合症病毒的噬菌体，再从该噬菌体中筛选出能够抑制病毒复制的噬菌体单克隆，该噬菌 体展示的多肽即能高效检测猪繁殖与呼吸综合症病毒。本专利技术采用噬菌体展示技术筛选获得可特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的 多肽，该方法周期短，操作简单，与目前采用制作单克隆抗体的方法相比，更为方便，快捷； 筛选到的多肽能够特异性的结合猪繁殖与呼吸综合症病毒，用于检测PRRSV，操作简单，具 有高特异性和很高的灵敏度。附图说明图1表示噬菌体与PRRSV结合特异性ELISA检测结果；图2为FITC标记的多肽检测PRRSV的图示。具体实施例方式实旅例1筛选与猪繁殖与呼吸综合症病毒特异性结合的噬菌体1.PRRSV病毒的纯化细胞方瓶中培养Marc-145细胞，37°C培养36小时加入PRRSV液500yL，用2% (ν/ ν)小牛血清的DMEM培养液(美国Gibcol公司)在37°C、5% CO2条件下培养，出现典型病 变时，将培养病毒-20°C冻存。将冻存的PRRSV培养细胞反复冻融3次，5000转离心10分 钟，取上清，向其中加入10% (10g/100mL)的PEG-8000 (Sigma公司)4°C过夜。14000转离 心20分钟沉淀PRRSV。沉淀悬于PBS缓冲液得到PRRSV悬液，-80°C保存，留作病毒TCID5tl 测定。用NTE缓冲液制备蔗糖梯度(30%、45%、60% )，将PRRSV悬液缓慢加入梯度上面， 35000转(L902K超高速离心机，美国Beck-man) 4°C，离心3小时，吸取45%至60%之间的 可见区带，-80°C速冻保存。蔗糖梯度离心所得的PRRSV悬液，用PBS透析去蔗糖，PEG20000 浓缩，获得纯病毒，分装到1. 5mL离心管，-80°C保存。采用紫外分光法，测定样品蛋白浓度。2.噬菌体随机肽库筛选 2. 1第一轮筛选——PRRSV筛选噬菌体随机肽库 在150 μ L包被液中加入2 μ L纯病毒，包被96孔酶标板，置于潮湿环境中于4°C过 夜。次日倾去包被液，每孔加入200 μ L浓度为lOmg/mL的BSA封闭液，37°C封闭2小时。倾 去封闭液，用 TBST (TBS+0. (v/v) Tween-20)洗涤 6 次，加入 1. 5 X IO11 个(100 μ L TBST 中)噬菌体(Ph. D.-12 Phage Display P印tide Library Kit，购自 NewEngland Biolabs 公司)，37°C反应60分钟。倾去噬菌体，用TBST洗10次，加入100 μ L洗脱液，轻摇洗脱至 多10分钟，将洗脱物转至1. 5mL离心管中，立刻加入15 μ L浓度为IM的Tris-HCl (ρΗ9· 1) 中和，即为第一轮洗脱产物(筛选产物)。取10 μ L洗脱产物进行滴度测定，剩余洗脱物加 入 20mL 对数生长早期(OD600 0.3)的宿主菌 ER2738 (Ph. D.-12 Phage Display Peptide Library Kit，购自 New England Biolabs 公司)中，37°C 培养 4. 5 小时，10000 转离心 10 分钟，取上清，再离心一次，取80%上清至50mL离心管中，加入1/6体积PEG-NaCl，4°C沉淀 过夜。次日10000转离心15分钟，取沉淀，用ImLTBS悬浮，转到1. 5mL离心管中，离心5分钟去掉残余的细胞碎片，将上清转至一新管中，加1/6体积PEG-NaCl沉淀1小时，离心1分 钟，取沉淀，用200yL TBS,0. 02% (质量浓度)NaN3悬浮，离心1分钟去掉未溶的残渣，将 上清转至一新管中，即为第一轮洗脱产物的扩增液。2. 2噬菌体滴度测定将步骤2. 1获得的第一轮洗脱产物的扩增液做10_8 10_"(洗脱产物ICT1到10_4) 四个连续10倍稀释后，取10 μ L加入到200 μ L过夜培养的ER2738宿主菌，室温作用5分 钟，然后加入到3mL 60°C预热的顶琼脂中，快速铺于LB/IPTG/X-gal平皿上，37°C培养过 夜，对蓝斑进行记数，算出噬菌体滴度。2. 3进一步筛选重复步骤2. 1和2. 2的方法再进行两轮筛选，每次的筛选对象为上一轮洗脱产 物或其扩增液，所用噬菌体含量为1.5X IO11PFU(利用噬菌体滴度算出所需扩增产物的体 积)，但是将筛选过程中用到的TBST中Tween-20的含量提高到0. 5% (ν/ν)。第三轮筛选 产物不做扩增，直接测定滴度，挑选单克隆用于ELISA鉴定。噬菌体随机肽库筛选结果如下表轮次 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽，其氨基酸序列如下：Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐海，于辙，吕芳，侯继波，
申请(专利权)人：国家兽用生物制品工程技术研究中心，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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