一种在易受感染的组织培养物中（使）ＰＲＲＳＶ生长，以使病毒复制达到足以保护动物抵御ＰＲＲＳ或用于诊断ＰＲＲＳ或为研制重组产品而鉴定ＰＲＲＳＶ分子结构的数量的方法，包括将病毒接种到组织培养物上然后收集复制的病毒。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术背景专利
本专利技术涉及一种猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)分离物。本专利技术尤其涉及猪生殖和呼吸疾病的诊断和保护抗原及疫苗，以及获得和使用它们的方法。现有技术的简要描述对于美国和欧洲的猪生产者，猪生殖和呼吸综合症作为一种经济上的灾难性疾病迅速出现。该综合症于1987年首先在美国有所描述，二到三年后，在欧洲和加拿大也出现了类似的报道。这种疾病综合症有许多不同的名称，包括神秘猪病、流产胎blau、蓝耳猪病、猪流行性流产和呼吸综合症(PEARS)、猪不育和呼吸综合症(SIRS)。在下文使用“猪生殖和呼吸综合症”(PRRS)这一名称。已鉴定出能再现此疾病综合症的病原学因子为一种小包膜的球形RNA病毒，病毒粒子平均直径为62nm并含有包膜的25-30nm的核。这种病毒初步归为外衣病毒科Arterivirus属的一种。猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)分离物，如本文所述，符合这一初步的分类，并且能再现这种疾病综合症。与PRRSV有关的这种疾病综合症，其特征在于在成年母猪中的急性和慢性的生殖衰竭在小猪中能使轻度呼吸疾病恶化。这种生殖衰竭的特征是后期流产，结果增加了干瘪的、死产的及弱产猪的发生率，从而大大降低了存活率。已描述了在被感染的母猪中，具有推迟发情期等症状的慢性疾病。呼吸疾病的后遗症包括从小猪中的高热及间质性肺炎到轻度上呼吸道征兆(即打喷嚏、咳嗽、鼻涕或眼屎)不等。近年(1990)的血清学及猪群病史研究表明，至少50％的美国猪群已接触了PRRSV或已经遭受了PRRSV感染的生殖衰竭及呼吸疾病。由于近来出现了这种疾病综合症，对于该病发病机理、流行病学及控制该病的研究就显得非常有限。由于意识到这个问题，有效繁殖及加工含有PRRSV的抗原将促进PRRSV疫苗的发展，该疫苗有助于预防和控制猪生殖和呼吸综合症。本专利技术概述如前所述，本专利技术包括一种被称为ISU-P的病毒分离物，其用于制备一种抗原，该抗原可诊断猪生殖和呼吸综合症并能诱导一种对猪生殖和呼吸疾病综合症病毒(PRRSV)的保护性免疫反应。本专利技术同时也包括获得和使用该抗原的方法。在本专利技术的一个实施例中，PRRSV分离物可通过一种方法得到，该方法包括在35℃共同培养10％重量/体积(w/v)的来自感染猪的肺匀浆与原猪肺泡巨噬细胞或连续细胞系培养物分离PRRSV。本专利技术进一步包括在特定的细胞系(如非洲绿猴肾连续细胞系(MA104)及其特有的克隆衍生物(9009B)以繁殖高效价的该病毒。本专利技术还包括制备和使用活病毒或杀死的病毒抗原(常规的或重组体)及由此通过将免疫学有效量的病毒分别与稀释剂和/(或)佐剂结合而产生疫苗的方法。已发现用活病毒进行直接实验免疫的猪或与活病毒免疫的猪接触，用强毒力的PRRSV进行鼻内攻击后，可预防生殖衰竭。与未接种的对照猪相比，根据在接种中无病毒复制测量的，发现灭活的加有佐剂的PRRSV可使猪免于PRRS感染后攻击。本专利技术的详细描述如上所述，本专利技术的目的在于分离PRRSV病毒分离物ISU-P，从而获得可用于疫苗及诊断检测的病毒抗原。ISU-P分离物是从一个弱产猪的肺组织获得。例如，为减少污染的可能性在抗生素补充的基础营养培养基(Minimal Essential Melia)(MFM＋A)中制备10％W/V的肺、脾和淋巴结组织匀浆。粗制的匀浆在4℃，1500×g离心15分钟以使之澄清。澄清上清液用MEM＋A以1∶5稀释，然后在25cm3烧瓶中将1.0ml的上清液吸附到一个48小时的汇合单层MA104细胞上或原肺泡巨噬细胞上。在35℃吸附2小时后，用MEM＋A洗涤单细胞层两次，接着加入用50％γ-照射的胎牛血清补充的5.0ml MEM＋A。病毒分离烧瓶在5％CO2大气中于35℃培养，并且每天观察是否有病毒致细胞病变作用(CPE)迹象。当5-10个细胞的小病灶开始变成圆时即开始了PRRSV ISU-P的病毒致细胞病变作用，此效应随许多细胞致密化而进一步发展，并在感染4到7天后从底物分离。用被公称为SDOW 17的PRRSV类特异性的单克隆抗体通过荧光抗体染色证实ISU-P分离物即为一种PRRSV分离物。此外，通过透射式电子显微镜，根据病毒粒子的存在，检测负染色的病毒感染细胞。观察到的病毒粒子是球形的，并且包有平均病毒粒子直径为65nm和核直径为27nm的被膜。以此为特征的组织培养病毒被用于在怀孕的母猪上试验性再现后期流产及生殖衰竭(表1)。表1表明，接触了ISU-P-感染的肺匀浆(PRRS-hm)或在细胞培养生长中的ISU-P(PRRS-tc)的怀孕小母猪表现出典型的猪生殖和呼吸综合症的征兆。在PRRS-hm组中，没有一只正常猪产仔。在PRRS-tc组中，33只猪中只有4只生下了正常的小猪。相比之下，未感染的30只猪中，有29只(96.7％)正常产了仔。ISU-P，甚至在组织培养中纯化后，仍然能再现PRRS这种疾病，这一事实证实了将此分离物归为外衣病毒Arterivirus属是正确的。同时也发现这种分离物在试验性感染的猪上可引起轻度间质性肺炎。本专利技术的一个特征是，本专利技术的PRRSV可以在能有效地复制此病毒的特定的组织培养细胞中生长，以达到足够的水平从而供给掺入至疫苗中所必需的抗原物质，该疫苗可以保护猪和(或)怀孕小母猪或大母猪不受PRRS攻击。例如，PRRSV能够在一种被称为MA104(由Whittaker BioProducts得到)的组织培养细胞中生长。在相同的培养条件下，利用从三种不同来源获得的MA104细胞进行病毒繁殖试验，结果表明，就满足PRRSV复制到高效价的能力而言，在MA104细胞之间有着高度的可变性。一种被Miles Inc.，AgricultureDivision，Animal Health Products Group称为MA104(M)的用于在此所述研究中的MA104细胞培养物，可一直保证PRRSV复制至高效价。而且，一种从MA104(M)产生的细胞系克隆(由Miles Inc.，Agriculture Division，Animal Health Products Group生产)，命名为9009B，可以满足PRRSV复制至比亲代细胞系更高的效价。因此，适用于ISU-P生长的组织培养细胞优选地是9009B。以下进一步阐明细胞培养繁殖PRRSV ISU-P。组织培养细胞生长并保持在Dulbecco′s改性的基础营养培养基、高葡萄糖(DMEM/HG)中，用5％胎牛血清补充同时用1.3g/l的碳酸氢钠缓冲处理。由足够的细胞数进行细胞传代以在48小时内达到80—100％的汇合单细胞层。在用PIPES缓冲至pH6.8的DMEM/Hg＋5％胎牛血清中稀释PRRSV ISU-P病毒母液。将病毒以低复合感染(MOI)接种到细胞板上并在36℃培养。每日观察被感染的培养物的CPE4-7天。当CPE明显为90-100％时，收集被感染的培养物。在一个-70℃凝固/融化循环后，即可获得最大量的病毒抗原。从MA104(M)细胞中繁殖得到的平均病毒效价为103.0到104.5荧光抗体感染剂量50/ml(FAID50/ml)。在9009B细胞克隆繁殖得到的病毒效价为105.5到106.5FAID50/ml。这种范围的效价有可本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：T·桑德逊，M·J·麦金利，J·J·齐默曼，H·T·希尔，M·C·米兹，E·C·皮尔特尔，S·L·施文森，G·P·希布利，
申请(专利权)人：美国拜尔公司，衣阿华州立大学研究基金公司，
类型：发明
国别省市：
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