免疫细胞的诱导扩增方法技术

本发明专利技术提出了一种免疫细胞的诱导扩增方法。该方法包括：(1)将单个核细胞接种到生物反应器中并在37℃、2～7％CO2、8～10％O2以及无菌条件下培养一天，所述生物反应器中预先包被抗人CD61抗体，所述生物反应器中包含第一培养基，所述第一培养基为包含10％自体血浆、1000IU/ml IL‑2以及0.01KE/ml沙培林的T细胞扩增培养基；(2)将经过步骤(1)培养处理的单个核细胞继续培养14～21天，以便获得所述免疫细胞，其中，继续培养的第1～8天，是在第二培养基和在37℃、2～7％CO2、8～10％O2以及无菌条件下进行的，所述第二培养基为包含10％自体血浆以及1000IU/ml IL‑2的T细胞扩增培养基或包含1000IU/ml IL‑2的T细胞扩增培养基；继续培养的第9～21天，是在第三培养基和在37℃、12～18％O2、2～7％CO2以及无菌条件下中，所述第三培养基为包含1000IU/ml IL‑2的SuperCulture TM L500培养基。

【技术实现步骤摘要】
免疫细胞的诱导扩增方法
本专利技术涉及生物领域，具体地，本专利技术涉及免疫细胞的诱导扩增方法。
技术介绍
细胞免疫治疗疗法，是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。然而现有技术中，将获得的人体自身免疫细胞经过体外培养存在扩增效率低、免疫细胞均一性差，回输到患者体内，致瘤几率大的问题。细胞免疫治疗疗法的应用受到限制。因此，如何进一步有效提高免疫细胞的扩增效率、提高扩增后免疫细胞的均一性以及将致瘤风险降到最低，是科研工作者拭待解决的关键问题。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种免疫细胞的诱导扩增方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)将单个核细胞接种到生物反应器中并在37℃、2～7％CO2、8～10％O2以及无菌条件下进行培养一天，所述生物反应器中预先包被抗人CD61抗体，所述生物反应器中包含第一培养基，所述第一培养基为包含10％自体血浆、1000IU/mlIL-2以及0.01KE/ml沙培林的T细胞扩增培养基；(2)将经过步骤(1)培养处理的单个核细胞继续培养14～21天，以便获得所述免疫细胞，其中，继续培养的第1～8天，是在第二培养基和在37℃、2～7％CO2、8～10％O2以及无菌条件下进行的，所述第二培养基为包含10％自体血浆以及1000IU/mlIL-2的T细胞扩增培养基或包含1000IU/mlIL-2的T细胞扩增培养基；继续培养的第9～21天，是在第三培养基和在37℃、12～18％O2、2～7％CO2以及无菌条件下进行的，所述第三培养基为包含1000IU/mlIL-2的SuperCultureTML500培养基或包含1000IU/mlIL-2和1mg/ml白酒草皂苷S的SuperCultureTML500培养基。利用根据本专利技术实施例的上述免疫细胞的诱导扩增方法，所获得的免疫细胞的扩增效率大幅提高，其培养12天后，免疫细胞可扩增120倍以上，培养14天后，免疫细胞可扩增200倍以上；并且所获得免疫细胞中的NK细胞的比例大幅提高，可提高到94％以上，以此同时，T淋巴细胞、辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的比例大幅下降，B淋巴细胞基本消失，所获得的免疫细胞的均一性显著提高；并且免疫细胞的致瘤风险为零。根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，将经过步骤(1)培养处理的单个核细胞继续培养12～14天，以便获得所述免疫细胞。进而所获得的的免疫细胞的活性更高、致瘤风险进一步降到最低。根据本专利技术的实施例，所述方法进一步包括：继续培养的第14天，将经过13天继续培养的单个核细胞进行回收和重悬处理，以便获得所述免疫细胞，所述重悬处理是在含有5％人血清白蛋白的生理盐水中进行的。进而可将所获得免疫细胞进行病原体检测，病原体检测合格的免疫细胞可进一步回输到患者体内进行免疫治疗，免疫治疗的风险进一步降低。根据本专利技术的实施例，在步骤(1)和所述继续培养的第1～8天，所述培养是在37℃、5％CO2、9％O2以及无菌条件下进行的，通过该阶段培养大量扩增淋巴样干细胞。所述继续培养的第9～13天，所述培养是在37℃、15％O2、5％CO2以及无菌条件下进行的，通过高氧条件，使第一阶段扩增的淋巴样干细胞加速向NK细胞诱导分化。根据本专利技术的实施例，所述T细胞扩增培养基为OpTmizerTMCTSTMT-cellexpansionSFM培养基。进而T细胞扩增效率进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述IL-2购自PeproTech。根据本专利技术的实施例，所述单个核细胞来源于外周血。外周血单个核细胞取材方便。需要说明的是，外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。根据本专利技术的实施例，外周血单核细胞是通过如下方式分离获得的：(1-1)将快检合格的外周血进行第一离心处理，所述离心处理是在2500rpm的条件下进行15min；(1-2)将经过第一离心处理获得的上层血浆进行第二离心处理，所述第二离心处理是在3500rpm的条件下进行15min,以便获得上清血浆和血细胞沉淀；(1-3)将所述上清血浆进行灭活和第三离心处理，以便去除补体，所述灭活处理是在温度为56℃的条件下进行30～50min，所述第三离心处理处理是在3500rpm的条件下进行15min；(1-4)将所述血细胞沉淀利用包含体积分数为50％的生理盐水进行重悬处理，并向重悬液中加入总体积1/3量的羟乙基淀粉；(1-5)将步骤(1-4)中所获得重悬液进行静置处理，以便沉降红细胞；(1-6)将步骤(1-5)所获得的上层重悬液进行第四离心处理，以便获得白细胞沉淀，所述第四离心处理是在1800rpm的条件下进行5min；(1-7)将所述白细胞沉淀利用生理盐水进行重悬处理，以便获得重悬液；(1-8)将步骤(1-7)所获得的重悬液等体积加入人外周血淋巴细胞分离液，并将所得混合液在2000rpm的条件下离心25min，以便获得中间云雾层白细胞；(1-9)将中间云雾层白细胞利用生理盐水洗涤2次，经过生理盐水洗涤的中间云雾层白细胞为所述单个核细胞。需要说明的是，一般意义上的白细胞包括粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，而经过根据本专利技术实施例的上述方法分离获得中间云雾层白细胞包括淋巴细胞和单核细胞，即本申请所述的单个核细胞。利用根据本专利技术实施例的上述方法获得单个核细胞的成活率和细胞活性高，进而用于进一步的诱导扩增，免疫细胞的扩增效率、获得的免疫细胞的活性均会得到进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述人外周血淋巴细胞分离液主要包括葡聚糖(右旋糖酐)和泛影酸葡甲胺。根据本专利技术的实施例，所述生物反应器中预先包被抗人CD61抗体是通过如下方式进行的：将包含2.5μg/mL抗人CD16单克隆抗体的生理盐水加入生物反应器中，并将所述生物反应器在4℃的条件下避光孵育过夜；依次利用生理盐水和所述T细胞扩增培养基将经过孵育处理的生物反应器进行洗涤处理。进而免疫细胞的诱导分化效率进一步提高，细胞的均一性也会进一步提高。在本专利技术第二方面，本专利技术提出了一种免疫细胞。根据本专利技术的实施例，所述免疫细胞是通过前面所述的方法获得的。根据本专利技术实施例的免疫细胞的活力高、均一性高(其中NK细胞的比例可达94％以上)、无致瘤风险。在本专利技术第三方面，本专利技术提出了白酒草皂苷S在免疫细胞诱导扩增中的应用。在本申请人的在先申请中，发现了白酒草皂苷R在免疫细胞冻存中具有有益的效果，本专利技术团队进一步研究发现，白酒草皂苷R在免疫细胞诱导扩增中，效果不是非常明显，但是和他接近的白酒草皂苷S却被发现有出乎预料的促进增殖，提高NK细胞的比例的技术效果。白酒草皂苷S：白色晶体(甲醇)，mp241～243℃，[α]20D-38.2°(c0.50,MeOH)。HR-ESI-MSm/z:1523.6566(计算值1523.6518，[M+Na]+)，相对分子质量较白酒草皂苷R高162，结合13C-NMR和DEPT谱确定其分子式为C68H108O36。白酒草皂苷S较白酒草皂苷R多了1组β-D-吡喃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫细胞的诱导扩增方法，其特征在于，包括：(1)将单个核细胞接种到生物反应器中并在37℃、2～7％CO2、8～10％O2以及无菌条件下进行培养一天，所述生物反应器中预先包被抗人CD61抗体，所述生物反应器中包含第一培养基，所述第一培养基为包含10％自体血浆、1000IU/ml IL‑2以及0.01KE/ml沙培林的T细胞扩增培养基；(2)将经过步骤(1)培养处理的单个核细胞继续培养14～21天，以便获得所述免疫细胞，其中，继续培养的第1～8天，是在第二培养基和在37℃、2～7％CO2、8～10％O2以及无菌条件下进行的，所述第二培养基为包含10％自体血浆以及1000IU/ml IL‑2的T细胞扩增培养基或包含1000IU/ml IL‑2的T细胞扩增培养基；继续培养的第9～21天，是在第三培养基和在37℃、12～18％O2、2～7％CO2以及无菌条件下进行的，所述第三培养基为包含1000IU/ml IL‑2的SuperCulture TM L500培养基或包含1000IU/ml IL‑2和1mg/ml白酒草皂苷S的SuperCulture TM L500培养基。

【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞的诱导扩增方法，其特征在于，包括：(1)将单个核细胞接种到生物反应器中并在37℃、2～7％CO2、8～10％O2以及无菌条件下进行培养一天，所述生物反应器中预先包被抗人CD61抗体，所述生物反应器中包含第一培养基，所述第一培养基为包含10％自体血浆、1000IU/mlIL-2以及0.01KE/ml沙培林的T细胞扩增培养基；(2)将经过步骤(1)培养处理的单个核细胞继续培养14～21天，以便获得所述免疫细胞，其中，继续培养的第1～8天，是在第二培养基和在37℃、2～7％CO2、8～10％O2以及无菌条件下进行的，所述第二培养基为包含10％自体血浆以及1000IU/mlIL-2的T细胞扩增培养基或包含1000IU/mlIL-2的T细胞扩增培养基；继续培养的第9～21天，是在第三培养基和在37℃、12～18％O2、2～7％CO2以及无菌条件下进行的，所述第三培养基为包含1000IU/mlIL-2的SuperCultureTML500培养基或包含1000IU/mlIL-2和1mg/ml白酒草皂苷S的SuperCultureTML500培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将经过步骤(1)培养处理的单个核细胞继续培养12～14天，以便获得所述免疫细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包括：继续培养的第14天，将经过13天继续培养的单个核细胞进行回收和重悬处理，以便获得所述免疫细胞，所述重悬处理是在含有5％人血清白蛋白的生理盐水中进行的。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将单个核细胞接种到生物反应器中并在37℃、5％CO2、9％O2以及无菌条件下进行培养一天；继续培养的第1～8天，是在第二培养基和在37℃、5％CO2、9％O2以及无菌条件下进行的；继续培养的第9～13天，是在第三培养基和在37℃、15％O2、5％CO2以及无菌条件下进行的。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T细胞扩增培养基为OpTmizerTMCTSTMT-cellexpansionSFM培养基。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐智峰，张新，
申请(专利权)人：广州沙艾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44