从富血小板血浆制备血小板裂解物的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过以下步骤从富血小板血浆(PRP)制备血小板裂解物的方法：(i)将富血小板血浆浸入液氮中，(ii)在37℃将所述富血小板血浆解冻，和(iii)随后再重复步骤(i)和(ii)3次。

Preparation of platelet lysates from platelet rich plasma

The invention relates to a method for preparing platelet lysates from platelet rich plasma (PRP) by following steps: (I) immersing platelet rich plasma into liquid nitrogen, (II) thawing the platelet rich plasma at 37 degrees, and (III) then repeat the steps (I) and (II) for 3 times.

【技术实现步骤摘要】
从富血小板血浆制备血小板裂解物的方法本申请是分案申请，其原申请的申请号为201280033446.3，申请日为2012年7月6日，专利技术名称为“中胚层谱系祖细胞”。
本专利技术涉及中胚层谱系祖细胞及其治疗应用以及制备血小板裂解物的方法。
技术介绍
间充质干细胞(MSC)是多能的成体干细胞。MSC分化形成见于骨骼组织中的不同的特化细胞。例如，它们能分化为软骨的细胞(软骨细胞(chondrocyte))、骨细胞(成骨细胞)和脂肪的细胞(脂肪细胞(adipocyte))。MSC用于多种疗法中，例如对年龄相关性黄斑变性(AMD)和心肌梗塞的治疗。一旦被施用至患者，MSC通常会迁移(或归巢)至受损的组织处并通过旁分泌信号传导以及通过促进受损组织中的相邻细胞的存活、修复和再生而发挥其治疗效果。目前的疗法通常涉及MSC亚型混合物的输注，而这些亚型中的某些并不能高效地迁移至所关注的组织。这使得需要使用高的细胞剂量，而这可能导致离靶(off-target)副作用和体积相关的副作用。MSC通常获自骨髓，因此其难以大量获得。
技术实现思路
本专利技术人令人惊讶地鉴定出了一类新的具有特定标志物表达谱的中胚层谱系祖细胞(PML)。本专利技术的PML的同源群能从单个核细胞(MC)(例如外周血MC)中分离出。所述PML能够高效地迁移至受损组织并对其进行修复。本专利技术提供了一种中胚层谱系祖细胞，其中，所述细胞(a)表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD271并且(b)不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45。本专利技术还提供了：-包含两种以上的本专利技术的祖细胞的群；-一种药物组合物，其包含(a)本专利技术的祖细胞或本专利技术的群以及(b)药物可接受的载剂或稀释剂；-一种制备本专利技术的群的方法，其包括：(a)在诱导单个核细胞(MC)分化为中胚层谱系祖细胞的条件下培养MC；和(b)收集具有本专利技术的表达谱的祖细胞并进行培养，由此制备本专利技术的群；-一种修复患者的受损组织的方法，其包括对患者施用本专利技术的群并由此修复患者的受损组织，其中所述群包含治疗有效数量的细胞；和-用于修复患者的受损组织的本专利技术的群。附图说明图1显示了RT-PCR凝胶，其证实了本专利技术的PML中存在CD44而不存在CD34。图2显示了对本专利技术的PML的FACS分析的结果。这证实了所述细胞至少呈CD73和CD90阳性，而对CD14、CD34和CD45呈阴性。图3显示了来自FACS分析的进一步结果，即针对CD90(上图)和CD73(下图)的柱形图。图4显示了在染色的细胞(图4a)和未染色的细胞(图4b)中缺乏CD14、CD34和CD45的FACS柱形图。图5显示了中胚层谱系祖细胞以时间依赖性和CXCR4依赖性方式迁移至骨折部位。在接受了PML-P-Act-Luc(PML)(左列)、PML-fl-Act-Luc-CXCR4+(CXCR4(+))(中列)或PML-P-Act-Luc-CXCR4-(CXCR4(-))(右列)移植物的胫骨骨折的小鼠骨折/移植后的第1天(第1行)、第3天(第2行)、第7天(第3行)和第14天(第4行)进行生物发光分析。具体实施方式应该理解，针对本领域的具体需要，可以对所公开的产品和方法的不同应用进行定制。此外还应理解，本文所用的术语的目的仅在于描述本专利技术的特定实施方式，而非意在进行限制。另外，除非文中明确地另有规定，本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”都包括复数的指代物。因此，例如，对于“一个细胞”的指代包括“多个细胞”，对于“一种组织”的指代包括两种以上的组织，对于“一位患者”的指代包括两位以上的患者，等等。本文中所引用的所有出版物、专利和专利申请，不论在上文还是下文中，均通过援引将其全部内容并入本文中。本专利技术的PML本专利技术提供了一种中胚层谱系祖细胞(PML)。所述PML表达可检测水平的CD29,CD44,CD73,CD90,CD105和CD271，但不表达可检测水平的CD14,CD34和CD45。本专利技术的PML具有许多优点。在此将总结其主要优点。然而，根据下文的讨论，其它优点将变得显而易见。本专利技术的PML可以有利地用于修复患者的受损组织。PML能够高效地迁移(或归巢)至受损组织并在该组织中发挥抗炎效应。这将在下文更详细地讨论。PML的最重要的能力之一是迁移(或归巢)至受损部位，这涉及趋化作用。这以趋化因子信号传导为基础，并且利用诸如滚动(rolling)、粘附和迁徙(transmigration)等机制。PML的抗炎效应促进了受损组织中的相邻细胞的存活、修复和再生。这些细胞还能够发挥旁分泌效果，例如分泌血管生成因子、趋化因子和抗凋亡因子。如下文更详述讨论的，PML由取自人个体的单个核细胞(MC)(例如外周MC)产生。由于PML从MC产生，其可以容易地制备(例如从外周血)并且对于待治疗的患者而言可以是自体同源的，由此避免了患者的免疫排斥风险。原理上，可以从单个个体产生无限数量的PML，这是因为可以获得多种MC样品(即，多种血液样品)。当然可以从单个个体产生极大数量的PML。因此，本专利技术的PML可以以大的数量制得。本专利技术的PML在临床相关条件下制备，例如，在不存在痕量的内毒素和其它环境污染物以及动物产品(例如胎牛血清)的情况下制备。这使得本专利技术的PML特别适于施用至患者。由于本专利技术的PML产自MC，其是基本同源的，并且可以是自体同源的。其还避免了供体-供体间差异，这种差异往往出现在间充质干细胞(MSC)中。本专利技术的许多PML群可以从取自尚未经受任何其它治疗(例如化疗或放射治疗)的患者的单个样品中产生。因此，本专利技术的PML能避免这些治疗的任何有害效果。本专利技术的PML可以快速制得。PML可以在小于30天(例如，约22天)内从MC制得。从MC制备PML避免了与使用源自人胚胎肝细胞(hESC)的间充质干细胞(MSC)相关的道德和伦理问题。本专利技术的PML通常产自人MC。因此，本专利技术的PML通常为人PML。可以利用本领域已知的标准方法(包括谱系限制性标志物的表达、结构和功能特征)将本专利技术的PML鉴定为中胚层谱系祖细胞。PML会表达可检测水平的已知为中胚层谱系祖细胞的特征的细胞表面标志物。特别地，除下文更详细讨论的标志物以外，PML还可以表达α-平滑肌肌动蛋白、I型胶原蛋白α链、GATA6、Mohawk和波形蛋白(SágiB等，StemCellsDev.2012年3月20日；21(5):814-28)。本专利技术的PML能够成功地在体外完成分化测定，从而证实其属于中胚层谱系。此类测定包括但不限于脂肪生成性分化测定、骨生成性分化测定和神经生成性分化测定(ZaimM等，AnnHematol.2012年8月；91(8):1175-86)。本专利技术的PML并不是干细胞。特别而言，其不是间充质干细胞(MSC)。它们是终末分化的细胞。虽然其在体外能够在正确的条件下被强制分化，例如分化为软骨或骨细胞，但其在体内并不分化。本专利技术的PML通过迁移至受损组织并在受损组织中进行旁分泌信号传导而发挥其效果。特别地，PML优选能够在受损组织中诱导抗炎效应。这将在下文更详细地讨论。本专利技术的PML通常以纺锤形形态为特征。PML通常为成纤维细胞样，即，其具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过以下步骤从富血小板血浆(PRP)制备血小板裂解物的方法：(i)将富血小板血浆浸入液氮中，(ii)在37℃将所述富血小板血浆解冻，和(iii)随后再重复步骤(i)和(ii)3次。

【技术特征摘要】
2011.07.06 GB 1111503.7;2011.07.06 GB 1111505.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·A·霍泽，M·J·埃文斯，A·雷金纳德，I·L·彼佩尔，B·L·珀金斯，
申请(专利权)人：细胞治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB