一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法技术

本发明专利技术涉及一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法。分离方法为：无菌操作取出肠道中后段，除去肠道外脂肪与肠系膜，纵向剖开肠管清除粪便，使用无菌弯头镊子刮除草鱼肠黏液与上皮细胞层，刮除时间15min；将除去黏液和上皮细胞层的肠段处理成碎块置于胶原酶IV消化液中消化，获得固有层单细胞悬液；再用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒分离肠巨噬细胞。纯化方法为：采用差异贴壁法纯化肠巨噬细胞。原代培养方法为：用含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液培养肠巨噬细胞，待细胞贴壁后用含脂多糖的RPMI 1640完全培养液换液一次，以后每隔2天换液一次，细胞至少可存活20天。本发明专利技术建立了一种可操作性强、重复性好的草鱼肠巨噬细胞分离、纯化和原代培养方法。

Isolation, purification and primary culture method for grass carp intestinal macrophages

Isolation, purification and primary culture method of the invention relates to a grass carp intestinal macrophages. Separation method: aseptic remove intestinal segment, remove intestinal fat and intestinal mesentery, longitudinally remove feces, using sterile elbow forceps curettage and grass carp intestinal mucus epithelial cell layer, scraping time 15min; will remove mucus and epithelial layer of the intestine and digested into fragments in collagenase IV digestion in the natural layer of single cell suspension; then the fish organ monocyte Isolation Kit isolated intestinal macrophages. The purification method was to purify intestinal macrophages by differential adherence. The method of primary culture of intestinal macrophages: the culture with grass carp RPMI 1640 autologous serum culture medium, after cell adhesion with lipopolysaccharide RPMI 1640 complete medium was changed once every 2 days later, was changed once, cells can survive at least 20 days. The invention provides a feasible and reproducible intestinal macrophages grass carp isolation and purification and primary culture method.

【技术实现步骤摘要】
一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法
本专利技术属于鱼类细胞培养
，具体涉及一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法。
技术介绍
肠道既是硬骨鱼类的消化吸收器官，也是其黏膜免疫器官。研究表明鱼类肠道不具有哺乳动物的组织化淋巴器官(如，Peyer氏淋巴集结及滤泡淋巴结),但在肠道中后段黏膜层分布着大量巨噬细胞(Macrophages)、淋巴细胞和粒细胞等免疫细胞，其中黏膜固有层富含的肠巨噬细胞除具有吞噬、杀伤和清除肠道病原微生物的功能外，还扮演着抗原递呈细胞的角色，发挥启动和调节肠黏膜免疫应答的作用。草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是中国四大家鱼之一，年产量超过400万吨，在所有淡水养殖鱼类中居首位。但随着草鱼养殖业的快速发展，疾病已成为制约其健康可持续发展的重要因素。疫苗接种是控制草鱼疫病的有效手段，而口服疫苗是水产养殖生产中最适用的疫苗类型。草鱼肠巨噬细胞的活性与功能是评价口服疫苗诱导的免疫应答水平，尤其是肠黏膜免疫水平的重要指标。由于巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2-3周，多用做原代培养，并且原代培养细胞与体内细胞的特性接近，能较真实地反映体内细胞的活性与功能。因此，很有必要建立规范的、可复制的草鱼肠巨噬细胞分离、纯化和原代培养方法，为检测草鱼肠道黏膜免疫水平，评价口服疫苗的免疫效果提供试验平台。现有的鱼类巨噬细胞分离培养技术中，从外周血、腹腔和头肾中分离巨噬细胞的方法已经比较成熟，且文献报道较多。然而，有关鱼类肠巨噬细胞的分离、纯化和原代培养方法尚未见有报道。首先，草鱼肠道细长弯曲、肠壁构成复杂，肠黏膜表面覆盖着大量黏液，巨噬细胞所在的固有层又含有致密的结缔组织，导致了草鱼肠巨噬细胞的分离存在困难。陆生恒温动物(小鼠、大鼠等)肠巨噬细胞的分离多采用DTT(硫苏糖醇)-EDTA(乙二胺四乙酸)分离法，并取得很好的分离效果。但我们的前期研究发现这种方法不适合生活在水环境中的变温动物草鱼，DTT-EDTA对草鱼巨噬细胞有损伤，细胞活力大大下降，培养12h后细胞就发生死亡。其次，草鱼肠巨噬细胞表面标记分子还知之甚少，也无标记分子特异性单克隆抗体，这给草鱼肠巨噬细胞的纯化带来难度。最后，适合于草鱼肠巨噬细胞原代培养的条件也不清楚。因此，如何有效分离、纯化和原代培养草鱼肠巨噬细胞成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法。为了实现本专利技术的第一个目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种草鱼肠巨噬细胞的分离方法，包括以下步骤：S1、在无菌环境下，获得健康草鱼中后段肠道之后对所述肠道做预处理，所述预处理的操作为：将所述肠道外脂肪与肠系膜除去，纵向剖开肠管并清除粪便，之后刮除肠道黏液以及上皮细胞层，最后用PBS缓冲液振荡清洗，得到肠壁明显变薄且颜色变为淡黄色至白色的肠段；S2、将所述肠段充分处理成碎块，并加入到胶原酶IV消化液中进行振荡消化，消化结束后过滤得到滤液，将所述滤液进行离心处理获得细胞沉淀物，将所述细胞沉淀物配制成肠黏膜固有层单细胞悬液；S3、按照鱼类脏器单核细胞分离试剂盒的说明从所述肠黏膜固有层单细胞悬液中分离得到肠巨噬细胞。进一步，所述步骤S1中健康草鱼中后段肠道的获取操作为：用自来水冲洗健康草鱼的体表后敲打草鱼头部致死，立即放入75％乙醇中浸泡20s，取出肠道中后段；所述预处理在含有预冷的PBS缓冲液的培养皿中进行，肠段用PBS缓冲液振荡清洗3次，所述PBS缓冲液的浓度0.01mol/L，pH7.4；所述步骤S1中，采用无菌弯头镊子刮除肠黏液与上皮细胞层；所述步骤S2中碎块的体积<1mm3，所述碎块置于胶原酶IV消化液中放入28℃振荡培养箱振荡消化2h，所述振荡培养箱的转速为250转/分钟；消化结束将所述胶原酶IV消化液过400目筛网获得滤液，之后将所述滤液以1800rpm离心8min并收集细胞沉淀物，使用Hank's平衡液洗涤所述细胞沉淀物并使用所述Hank's平衡液将所述细胞沉淀物配成浓度为1×108个/mL的肠黏膜固有层单细胞悬液。进一步，所述的胶原酶IV消化液由Hank’s平衡液、胎牛血清以及胶原酶IV组成，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的质量浓度为1.7mg/mL，所述Hank’s平衡液在胶原酶IV消化液中的体积百分数为95％，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的体积百分数为5％。为了实现本专利技术的第二个目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种所述草鱼肠巨噬细胞的纯化方法，用RPMI1640基础培养液将上述肠巨噬细胞悬液稀释后接种于细胞培养板并在培养箱中培养，培养4h后进行第一次换液，继续培养至12h后进行第二次换液，最终获得纯化后的草鱼肠巨噬细胞；换液时弃去全部陈旧培养液并加入新鲜的含草鱼自体血清的RPMI1640完全培养液。进一步，所述肠巨噬细胞悬液稀释后浓度为3×106个/mL；所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述细胞培养板接种量为100μL/孔；所述培养箱内温度28℃、CO2体积含量5％。进一步，所述RPMI1640基础培养液由RPMI1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液组成，所述RPMI1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液在RPMI1640基础培养液中的体积百分数分别为94％、5％、1％。进一步，所述的含草鱼自体血清的RPMI1640完全培养液由RPMI1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液构成，所述RPMI1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液在RPMI1640完全培养液中的体积百分数分别为84％、10％、5％、1％。为了实现本专利技术的第三个目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种所述草鱼肠巨噬细胞的原代培养方法，用含草鱼自体血清的RPMI1640完全培养液将纯化后的草鱼肠巨噬细胞液浓度进行调整后接种于细胞培养板并在培养箱中培养，待细胞开始贴壁生长后，用含脂多糖的RPMI1640完全培养液换液一次，以后每隔2天换液一次，换液时吸出一半旧培养液，再补加新鲜的含脂多糖的RPMI1640完全培养液。进一步，所述肠巨噬细胞悬液调整后浓度为3×106个/mL；所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述细胞培养板接种量为100μL/孔；所述培养箱内温度28℃、CO2体积含量5％。进一步，所述含脂多糖的RPMI1640完全培养液由RPMI1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清、脂多糖以及抗微生物液组成，所述RPMI1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液在含脂多糖的RPMI1640完全培养液的体积百分数分别为84％、10％、5％、1％；所述脂多糖在含脂多糖的RPMI1640完全培养液中的浓度为20μg/mL。本专利技术的有益效果在于：1)本专利技术首次建立了一种简单、可操作性强、重复性好的草鱼肠巨噬细胞分离、纯化和原代培养方法。2)本专利技术中除去肠黏液和肠上皮细胞层是分离肠巨噬细胞的关键起始步骤。除去陆生恒温动物(如小鼠和大鼠)肠黏液和肠上皮细胞层的方法是将肠段与含DTT和EDTA的缓冲液在37℃孵育30min以上，DTT可打断黏蛋白分子之间的二硫键而快速除去肠黏液，EDTA螯合剂能与肠上皮细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，使肠上皮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种草鱼肠巨噬细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：S1、在无菌环境下，获得健康草鱼中后段肠道之后对所述肠道做预处理，所述预处理的操作为：将所述肠道外脂肪与肠系膜除去，纵向剖开肠管并清除粪便，之后刮除肠道黏液以及上皮细胞层，最后用PBS缓冲液振荡清洗，得到肠壁明显变薄且肠壁颜色变为淡黄色至白色的肠段；S2、将所述肠段充分处理成碎块，并加入到胶原酶IV消化液中进行振荡消化，消化结束后过滤得到滤液，将所述滤液进行离心处理获得细胞沉淀物，将所述细胞沉淀物配制成肠黏膜固有层单细胞悬液；S3、从所述肠黏膜固有层单细胞悬液中分离得到肠巨噬细胞。

【技术特征摘要】
1.一种草鱼肠巨噬细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：S1、在无菌环境下，获得健康草鱼中后段肠道之后对所述肠道做预处理，所述预处理的操作为：将所述肠道外脂肪与肠系膜除去，纵向剖开肠管并清除粪便，之后刮除肠道黏液以及上皮细胞层，最后用PBS缓冲液振荡清洗，得到肠壁明显变薄且肠壁颜色变为淡黄色至白色的肠段；S2、将所述肠段充分处理成碎块，并加入到胶原酶IV消化液中进行振荡消化，消化结束后过滤得到滤液，将所述滤液进行离心处理获得细胞沉淀物，将所述细胞沉淀物配制成肠黏膜固有层单细胞悬液；S3、从所述肠黏膜固有层单细胞悬液中分离得到肠巨噬细胞。2.如权利要求1所述草鱼肠巨噬细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S1中健康草鱼中后段肠道的获取操作为：用自来水冲洗健康草鱼的体表后敲打草鱼头部致死，立即放入75％乙醇中浸泡20s，取出肠道中后段；所述预处理在含有预冷的PBS缓冲液的培养皿中进行，肠段用PBS缓冲液振荡清洗3次，所述PBS缓冲液的浓度0.01mol/L，pH7.4；所述步骤S1中，采用无菌弯头镊子刮除肠黏液与上皮细胞层；所述步骤S2中碎块的体积＜1mm3，所述碎块置于胶原酶IV消化液中放入28℃振荡培养箱振荡消化2h，所述振荡培养箱的转速为250转/分钟；消化结束将所述胶原酶IV消化液过400目筛网获得滤液，之后将所述滤液以1800rpm离心8min并收集细胞沉淀物，使用Hank's平衡液洗涤所述细胞沉淀物，并使用所述Hank's平衡液将所述细胞沉淀物配成浓度为1×108个/mL的肠黏膜固有层单细胞悬液。3.如权利要求2所述草鱼肠巨噬细胞的分离方法，其特征在于：所述的胶原酶IV消化液由Hank’s平衡液、胎牛血清以及胶原酶IV组成，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的质量浓度为1.7mg/mL，所述Hank’s平衡液在胶原酶IV消化液中的体积百分数为95％，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的体积百分数为5％。4.一种如权利要求1～3任一项所述草鱼肠巨噬细胞的纯化方法，其特征在于：用RPMI1640基础培养液将所述肠巨噬细胞稀释后接种于细胞培养板并在培养箱中培养，培养4h后进行第一次换液，继续培养至12h后进行第二次换液，最终获得纯化后的草...

【专利技术属性】
技术研发人员：李槿年，肖宁，陶会竹，赵雨婷，李琳，刘雪兰，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34