一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养及功能验证方法技术

本发明专利技术提供一种用于鱼类单核细胞的分离、培养、转化及功能验证方法，本发明专利技术通过优化培养参数和条件，成功的获得了鱼类吞噬细胞；利用吞噬细胞吞噬外源鸡红细胞和体外呼吸爆发检测获得的鱼类的吞噬细胞的功能。本发明专利技术方法实现了鱼类吞噬细胞的体外分离、转化、连续培养等，所需样品少，操作时间短，流程简单、准确性高，可广泛应用于鱼类免疫相关功能在细胞水平上的研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物细胞培养
，具体地说涉及一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养及功能验证方法。
技术介绍
随着近年来养殖规模的扩大，由鳗弧菌等有害细菌引起的病害问题严重阻碍了高经济价值鱼类（如半滑舌鳎）养殖产业的发展。目前尚无有效的免疫防治技术和方法，仍然采用化学药物和抗生素等传统的方式来控制病害的发生。外周血单核细胞（吞噬细胞的前体），是鱼类体液免疫的重要组成部分，在鱼类特异性免疫和非特异性免疫过程中起着重要作用。目前对于半滑舌鳎等鱼类单核细胞的免疫功能研究尚属起步阶段，尚不清楚其作用机制，而且目前为止未获得能连续培养用于细胞功能研究的半滑舌鳎吞噬细胞。吞噬细胞的前体是单核细胞，细胞呈球形、圆梨形或不规则形，表面有细长的伪足样胞突。单核细胞的核较小，呈肾形或马蹄形，常偏于一侧，核质比<1。在Giemsa染色中，单核细胞的细胞核呈网格状。透射电镜下，其胞质内有较多的线粒体，有时还有高尔基体、粗面型内质网、核糖体以及被吞噬的衰老细胞或其细胞核等。单核细胞具有较强的吞噬能力，在鱼类机体中发挥着重要的非特异性吞噬功能。它可通过伪足样胞突捕捉并融合外来物质以及自身的衰老细胞，并能产生活跃的变形运动。另外，单核细胞对环境变化也十分敏感，在生活于严重污染水域的鱼类中，单核细胞的含量可比正常情况高近50倍。在鱼类被寄生虫感染或被人为地注入胶碳颗粒等物质后，也可引起单核细胞数量的骤增。因此，通过测定鱼类单核细胞的数量，可以初步了解鱼类的健康状况及其生活水域的环境质量。单核细胞以及单核细胞转化后的吞噬细胞在抵抗和防御病原体感染中发挥重要作用，尤其是在细胞内的病原体防御中发挥了巨大的作用。另外，吞噬细胞还存在于被吞噬细胞吞噬后的碎片中，它们在天然免疫和获得性免疫中也发挥着至关重要的作用。根据组织内环境以及它们自身所处的不同分化及活性阶段，它们都表现出不同的机能、形态和代谢作用。单核细胞来源于骨髓中的造血前驱细胞，它经过2-3d的血液循环便移行到各个组织当中，从而分化形成组织中的吞噬细胞。获得能在体外长期存活并可传代培养的细胞，是进行细胞免疫学等研究的基础。常见单核细胞分离方法包括：血浆凝胶法，标准Ficoll法和Percoll-paque法。但是这些方法单独利用容易产生淋巴细胞、粒性白细胞、血小板和各种红细胞的混合悬液。
技术实现思路
针对现有技术的不足，为了解决上述问题，本专利技术提出一种用于鱼类单核细胞的分离、培养、转化及功能验证方法。具体的方案如下：一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养方法，其包括以下的步骤：步骤一：单核细胞的分离与培养；步骤二：单核细胞诱导为吞噬细胞的体外培养；进一步，步骤一中，具体步骤如下：S1:抽取鱼类外周血，以全血与Hank’s缓冲液1:2.5-1:3稀释混匀得稀释血液；S2:取稀释血液1.5倍量、比重1.05-1.09之间的淋巴细胞分离液与释释血液于离心管中；S2:水平离心机1800-2100rpm离心18-21分钟，收集单个核细胞层；S4:加入4-5倍体积的Hank’s缓冲液洗2次，900-1100rpm离心5min收集细胞沉淀；S5:重悬于DMEM完全培养基，接种在培养瓶置于24℃培养箱培养3h；S6:Hank’s缓冲液洗去上清，加入新鲜培养基继续培养贴壁细胞；S7:离心获得单核细胞层，即包括淋巴细胞和单核细胞；S8:将分离后的单个核细胞重悬于添加促贴壁生长因子bFGF并含10-15%胎牛血清的完全DMEM培养基中；S9:培养2-4h后洗去悬浮淋巴细胞，获得贴壁的单核细胞。进一步，步骤二中，具体步骤如下：S1:在含有单核细胞、15%胎牛血清的完全DMEM培养集中加入10-15%的淋巴细胞；S2:隔天半量换取新鲜DMEM完全培养基，培养3-12天。一种单核/吞噬细胞的功能验证方法，其包括以下的步骤：S1:将分离得到的单核细胞加佛波酯（PMA）刺激剂50ul，在23-25℃下孵育15min；S2:加二氢若丹明25ul，在24℃下避光孵育5min；S3:采用PBS缓冲液洗涤2次；S4:1500rpm离心5min；S5:去上清液，加0.5mlPBS缓冲液重悬细胞；S6:用上流式细胞仪检测。本专利技术的有益效果是：本专利技术用细胞分离液进行密度梯度离心，通过修正实验过程中的各种参数和实验条件，成功的分离纯化鱼类单核细胞（吞噬细胞），而后通过优化营养和培养条件，将半滑舌鳎单核细胞以贴壁生长的方式培养一周以上，可满足于后续实验。本专利技术成功进行了吞噬细胞的呼吸爆发检测，为深入研究单核/吞噬细胞的生物学特性和免疫学功能提供材料。附图说明图1为本专利技术实施例中单核细胞形态（A：培养12h；B：培养24h；C：培养32h；D：培养38h）；图2为本专利技术实施例中单核细胞生长曲线;图3为本专利技术实施例中PMA刺激下的呼吸爆发检测；图4为本专利技术实施例中鳗弧菌感染后的呼吸爆发检测；图5为本专利技术实施例中单核细胞与吞噬细胞；图6为本专利技术实施例中吞噬细胞的几种形态；图7为本专利技术实施例中老化的吞噬细胞；图8为本专利技术实施例中姬姆萨染色的吞噬细胞；图9为本专利技术实施例中吞噬鸡红细胞的吞噬细胞；图10为本专利技术实施例中培养第5天吞噬细胞染色体中期分裂相；图11为本专利技术实施例中吞噬细胞染色体数分布。具体实施方式为了使本领域的人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合本专利技术的附图，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：在鱼类外周血细胞中，各种细胞由于形态和重量的差异，导致在进行密度梯度离心时：比重最大的红细胞和粒细胞，次之的单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)，比重最小的血栓细胞会在分离时处于不同层次。因此，通过修正离心转速，离心时间，以及分离液的密度比例，就可以利用密度梯度离心的方法，将上述细胞进行分离。离心后，从上到下可分为透明的血浆层，呈白膜状的单个核细胞层，透明的分离液层，粒细胞和红细胞比重最大，沉在最下面，从而达到粗分离的目的；其次，白膜层中的淋巴细胞和吞噬细胞在培养基中培养时贴壁的能力存在差异，因此通过不通贴壁力的区分，可以成功分离吞噬细胞，细胞培养基中的血清能促进细胞生长，并有助于细胞贴壁，因此通过修正血清的加入量和加入时机，在培养一定时间后，通过修正胰酶浓度，来消化贴壁细胞可有效分离吞噬细胞和淋巴细胞；而且，在体外单核细胞会被吞噬细胞集落刺激因子（M-CSF）活化成吞噬细胞，吞噬细胞具有吞噬活性，呼吸爆发等特征。这是淋巴细胞和吞噬细胞之间最大的差异，可通过此条件鉴定吞噬细胞。实施例：以半滑舌鳎为例，介绍本专利技术的一种用于鱼类吞噬细胞的培养、功能验证及吞噬细胞的转化方法。1.半滑舌鳎外周血单核细胞的分离与培养半滑舌鳎于冰水中麻醉，70%酒精棉球擦拭背部尾静脉，肝素抗凝管抽取外周血2ml，于超净工作台中将全血与Hank’s缓冲液1:2.5-1:3稀释混匀，取比重1.05-1.09之间的淋巴细胞分离液3ml于15ml离心管中，加入2ml稀释血液于水平离心机1800-2100rpm离心18-21分钟，收集单个核细胞层，加入4-5倍体积的Hank’s缓冲液洗2次，9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养方法，其特征在于：其包括以下的步骤：步骤一：单核细胞（吞噬细胞前体）的分离与培养；步骤二：单核细胞体功能的鉴定；步骤三：单核细胞诱导为吞噬细胞。

【技术特征摘要】
1.一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养方法，其特征在于：其包括以下的步骤：步骤一：单核细胞（吞噬细胞前体）的分离与培养；步骤二：单核细胞体功能的鉴定；步骤三：单核细胞诱导为吞噬细胞。2.根据权利要求1所述的一种用于鱼类单核/吞噬细胞分离、培养方法，其特征在于：步骤一中，具体步骤如下：S1:抽取鱼类外周血，以全血与Hank’s缓冲液1:2.5-1:3稀释混匀得稀释血液；S2:取稀释血液1.5倍量、比重1.05-1.09之间的淋巴细胞分离液，与血液于离心管中混合；S2:水平离心机1800-2100rpm离心18-21min，收集单个核细胞层；S4:加入4-5倍体积的Hank’s缓冲液洗2次，900-1100rpm离心5min收集细胞沉淀；S5:重悬于DMEM完全培养基，接种在培养瓶置于24℃培养箱培养3h；S6:Hank’s缓冲液洗去上清，加入新鲜培养基继续培养贴壁细胞；S7:离心获得单核细胞层，即包括淋巴细胞和单核细胞；S8:将分离后的单个核细胞重悬于添加促贴壁生长因子bFGF并含10-15%胎牛血清的完...

【专利技术属性】
技术研发人员：沙珍霞，陈亚东，孙璐明，汪林庆，陈松林，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37