一株不产灵菌红素的粘质沙雷氏菌及其制备舍雷肽酶的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株不产灵菌红素的粘质沙雷氏菌突变株及其制备舍雷肽酶的应用，粘质沙雷氏菌MW‑9菌株不产灵菌红素，有效地改善了成品舍雷肽酶的品质；粘质沙雷氏菌MW‑9菌株产舍雷肽酶活性稳定，摇瓶发酵产酶活力稳定在1000U/mL左右。

A Serratia marcescens strain without producing bacteriin and its application in the preparation of serratitidase

The invention discloses a mutant strain of serenal mucilagin and the application of sereneptidase. The MW 9 strain of serioma mucilagus can effectively improve the quality of the sereniopeptidase, and the sereniopeptidase production is stable and the enzyme activity is stable in the shake flask fermentation of MW. It's around 1000U/mL.

【技术实现步骤摘要】
一株不产灵菌红素的粘质沙雷氏菌及其制备舍雷肽酶的应用(一)
本专利技术涉及一株不产灵菌红素的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)MW-9菌株，及其在发酵制备舍雷肽酶中的应用。(二)
技术介绍
舍雷肽酶(serratiopeptidase，serrapeptase或serralysin)，又名沙雷肽酶、沙雷蛋白酶等，是一种源于粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的碱性蛋白酶，最初产该酶的粘质沙雷氏菌E15菌株分离自家蚕蚕蛹肠道，蚕蛹就是利用肠道内粘质沙雷氏菌产生的舍雷肽酶破茧而出。舍雷肽酶被人们称之为“奇迹之酶”，它有良好的抗炎、抗肿胀、促进痰液、脓液溶解与排泄以及镇痛作用，临床用于手术后及外伤的消炎；副鼻窦炎、乳汁潴留性乳腺炎、膀胱炎、附睾炎、智齿周围炎及牙槽脓肿时的消炎；以及治疗支气管炎、肺结核、支气管哮喘时痰液不易咳出等。研究也表明，舍雷肽酶具有出色的纤溶活性，在治疗动脉粥样硬化方面也有潜在的应用。目前市场上已有舍雷肽酶相关药品，如国内市场上的“达先”、“释瑞达”和“曲坦”等，国外市场上的“Dasen”和“Seradase”等；舍雷肽酶也可作为非处方药使用，具有对抗炎症、解除疼痛和肿胀，加速复原与激发免疫系统等功效，产品如市场上的“Serretia”、“Natto-Serra”和“SerraGold”胶囊等。近些年来，因其良好的临床使用效果，舍雷肽酶的使用量逐年增长，特别是为辅助治疗药物和保健食品的市场急剧增长。目前，国内虽有一些企业在销售舍雷肽酶，但并非采用粘质沙雷氏菌发酵，而是采用枯草芽孢杆菌发酵的普通蛋白酶，此类产品不能称为舍雷肽酶，所以国内舍雷肽酶类药物的原料都从国外进口，也未见相关发酵工艺研究的报道。日本和印度工业化生产规模较大，国际市场多向这两个国家采购，所以国内迫切需要开发具自主知识产权的舍雷肽酶生产工艺。产舍雷肽酶的粘质沙雷氏菌，又名灵杆菌，是革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)沙雷氏菌属(Serrtia)。该菌的最大特征在28～30℃下培养产生鲜红的色素—灵菌红素(prodigiosin，又称灵杆菌素)；高于37℃培养不产生红色色素，灵菌红素具有抗菌、抑癌、提高免疫力等生理活性，也具有一定的开发潜质。中国专利技术专利CN201610407429.1公开了一株舍雷肽酶产生菌LL-413及其在发酵制备舍雷肽酶中的应用，所用的产酶菌株粘质沙雷氏菌LL-413分离自家蚕蚕蛹肠道，野生菌株在用于发酵生产舍雷肽酶中存在2个缺点，一是在30℃下产酶发酵，会产生红色色素—灵菌红素，酶的分离过程不能完全去除该色素，从而影响成品酶的色泽；二是产酶活力不稳定，随着菌种传代次数增多，产酶单位逐渐下降。为此，本专利技术对粘质沙雷氏菌LL-413进行了紫外线和微波连续诱变，选育出不产灵菌红素，产酶活力高且稳定的突变株，应用于舍雷肽酶的生产。(三)
技术实现思路
本专利技术提供一株产舍雷肽酶的突变菌株—粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)MW-9菌株，及其在制备舍雷肽酶中的应用，该菌株具有的显著优点是不产灵菌红素且产酶活力稳定，有效地改善了发酵中产酶活力不稳定性和产品色泽差的问题。本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供一株产舍雷肽酶，但不产灵菌红素的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)MW-9菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60315，保藏日期2018年1月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。所述的粘质沙雷氏MW-9菌株是以LL-413菌株(CCTCCNo：M2015780)为出发菌株，经过紫外线和微波连续诱变后筛选而来。较菌株LL-413相比，菌株MW-9的显著特点是不产灵菌红素，在30～37℃条件下培养，菌落呈乳白色(图3)，不再像LL-413菌株呈现的鲜红色(图2)。本专利技术还涉及所述的粘质沙雷氏菌MW-9菌株在发酵产舍雷肽酶中的应用，具体所述的应用是将粘质沙雷氏菌MW-9菌株接种入产酶培养基，于28～32℃、200～250r/min发酵24～36h，得舍雷肽酶活力为950～1000U/mL的发酵液，发酵液经过离心后去除菌体获得粗酶液，粗酶液经分离纯化即可得到舍雷肽酶；所述产酶培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5～11g/L，牛肉膏3.0～6.6g/L，麦芽浸粉10.0～12.2g/L，MgSO41g/L，NaCl5g/L，溶剂为水，初始pH为7.5～8.0，优选产酶培养基终浓度组成为：麦芽浸粉12.2g/L，牛肉膏6.6g/L，酵母浸出粉11.0g/L，NaCl5.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，溶剂为水，初始pH为8.0。所述粘质沙雷氏菌MW-9菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面活化培养，然后经种子培养、获得种子液再以体积浓度2％～5％的接种量接入产酶培养基进行培养，具体步骤如下：(1)将粘质沙雷氏菌MW-9菌株接种于斜面培养基，于30℃培养24～36h，得到活化后的斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，初始pH为7.0；(2)将步骤(1)活化后的斜面菌体接种至种子培养基中，于30℃、200～250r/min振荡条件下培养18～24h，得到种子液；所述种子培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5～11g/L，牛肉膏3.0～6.6g/L，麦芽浸粉10.0～12.2g/L，MgSO41g/L，NaCl5g/L，溶剂为水，培养基初始pH为7.5～8.0，优选种子培养基终浓度组成为：麦芽浸粉12.2g/L，牛肉膏6.6g/L，酵母浸出粉11.0g/L，NaCl5.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，溶剂为水，初始pH为8.0。本专利技术所述发酵液于4℃条件下5000×g离心10～15min，分离除去菌体，得澄清的舍雷肽酶粗酶液。本专利技术所述粘质沙雷氏菌MW-9菌株发酵所产的含舍雷肽酶粗酶液进行分离纯化的方法为：将粘质沙雷氏菌MW-9菌株发酵所得的舍雷肽酶粗酶液，经过硫酸铵(NH4SO4)沉淀、透析除盐和冷冻干燥后获得舍雷肽酶，具体的，所述分离纯化方法如下：(1)往舍雷肽酶粗酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到40～45％，4℃沉淀10～12h，之后于4℃、8000×g条件下离心10～15min，去除沉淀，保留上清液；(2)往步骤(1)中经硫酸铵沉淀后所得的上清液中再次加入硫酸铵，使其饱和度达到70～75％，4℃沉淀10～12h，之后将粗酶液于4℃、8000×g条件下离心10～15min，弃去上清液，沉淀物用pH值8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，此时得到舍雷肽酶粗品的浓缩液；(3)将步骤(2)所得浓缩液装入截留分子量为10～20kDa(优选14kDa)的透析袋中，以去离子水为透析液透析除盐后，于温度-40～-60℃、真空度5～10Pa冷冻干燥，即得到舍雷肽酶冻干酶粉。本专利技术中，所述的舍雷肽酶活力定义为：在37℃反应条件下，1min水解浓度为20g/L的酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量(mL)作为一个酶活力单位(U)。本专利技术所述粘质沙雷氏菌(Serratiamarcesc本文档来自技高网...

【技术保护点】
不产灵菌红素的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)MW‑9菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60315，保藏日期2018年1月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

【技术特征摘要】
1.不产灵菌红素的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)MW-9菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60315，保藏日期2018年1月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。2.一种权利要求1所述粘质沙雷氏菌MW-9菌株在发酵产舍雷肽酶中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是将粘质沙雷氏菌MW-9菌株接种入产酶培养基，于28～32℃、200～250r/min发酵24～36h，发酵液经过离心后去除菌体获得粗酶液，粗酶液分离纯化即可得到舍雷肽酶；所述产酶培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5～11g/L，牛肉膏3.0～6.6g/L，麦芽浸粉10.0～12.2g/L，MgSO41g/L，NaCl5g/L，溶剂为水，初始pH为7.5～8.0。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述粘质沙雷氏菌MW-9菌株在产酶培养前，先经斜面活化培养，然后经种子培养，获得的种子液再以体积浓度2％～5％的接种量接入产酶培养基进行培养，具体步骤如下：(1)将粘质沙雷氏菌MW-9菌株接种于斜面培养基，于30℃培养24～36h，得到活化后的斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅建凤，蔡少芬，应国清，易喻，陈建澍，张彦璐，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33