一株3-苯氧基苯甲酸降解菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株3‑苯氧基苯甲酸降解菌，该菌株为鞘氨醇单胞菌SC‑1 （

A strain of 3- phenoxy benzoate degrading bacteria and their application

The invention discloses a 3 - phenoxy benzoic acid degrading bacterium, which is Sphingomonas sp. SC 1.

【技术实现步骤摘要】
一株3-苯氧基苯甲酸降解菌及其应用
本专利技术提供一株3-苯氧基苯甲酸降解菌及其应用，属于生物

技术介绍
拟除虫菊酯类农药是人工合成的一类高效、广谱、神经致毒性杀虫剂，目前广泛用于农业、家庭卫生害虫的防治及粮食储藏等。大多数该类农药降解会产生中间降解产物—3-苯氧基苯甲酸，其疏水性相对较弱，毒性和迁移性强于其母体农药，易在环境中蓄积，半衰期长达180天。随着拟除虫菊酯类农药的大量使用，其降解中间产物—3-苯氧基苯甲酸在造成农产品二次污染的同时，也导致拟除虫菊酯类农药生物矿化作用受阻，从而阻断了该类农药彻底转化为无毒小分子物质的生物降解途径，间接地使土壤、水体、农产品或食品中农药残留问题更加严峻。微生物降解3-苯氧基苯甲酸具有条件温和、高效、适应性好、无二次污染的特点，是目前消除3-苯氧基苯甲酸残留的主要方法之一。但目前国内外筛选获得的可降解3-苯氧基苯甲酸的菌株种类较少，并且部分菌株不能完全矿化降解3-苯氧基苯甲酸，仍存在农药残留问题。另外，现有技术中已发现鞘氨醇单胞菌具有降解能力的专利(申请号：201510775953.X，申请公开号：CN105274031A，申请公布日：2016年1月27日)，所得的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)可用于增强韭菜中残留毒死蜱的降解，但未见可降解3-苯氧基苯甲酸的鞘氨醇单胞菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有3-苯氧基苯甲酸微生物降解中存在的不足，提供一株3-苯氧基苯甲酸高效降解菌。一株3-苯氧基苯甲酸降解菌，其特征在于该菌株的分类名称为鞘氨醇单胞菌SC-1(Sphingomonassp.SC-1)，于2016年5月18日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCNO：M2016270，该菌株16SrDNA的GenBank登录号为JN857975。一株3-苯氧基苯甲酸降解菌，其特征在于该菌株菌落呈无色透明，边缘整齐，表面湿润。单个菌体为杆状，革兰氏阴性，无芽孢。葡萄糖和甘油发酵均呈阳性，产酸产气；不水解明胶和淀粉；生长不需要氯化钠和氯化钾；苯丙氨酸脱氨酶阳性；需氧生长。一株3-苯氧基苯甲酸降解菌，其特征在于该菌株来源于农药厂污泥，经3-苯氧基苯甲酸梯度驯化、初筛、分离纯化、复筛得到。一株3-苯氧基苯甲酸降解菌，其应用在于该菌株能以3-苯氧基苯甲酸作为唯一碳源和能源生长；该菌株降解3-苯氧基苯甲酸的培养基组成(w/v)为硫酸铵0.15％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钾0.15％、吐温-800.2％、硫酸镁0.02％、氯化钠0.05％；培养条件为培养基初始pH7.0-7.5、接种量5.0％(v/v)、装液量30mL/250mL锥形瓶、培养温度35℃、摇床转速180r/min、培养时间24h；上述条件下该菌株对培养基中浓度为300μg/mL、500μg/mL、700μg/mL的3-苯氧基苯甲酸的降解率分别为100％、65.79％、33.13％。通过实施本专利技术的具体技术指标，可达到以下预期效果。目前具有3-苯氧基苯甲酸降解能力的菌株种类较少，其中大部分菌株不能完全矿化降解3-苯氧基苯甲酸。本专利技术提供的鞘氨醇单胞菌SC-1是一株3-苯氧基苯甲酸高效降解菌，能以3-苯氧基苯甲酸作为唯一碳源和能源生长；适宜条件下可完全降解浓度为300μg/mL的3-苯氧基苯甲酸，是目前已报道降解3-PBA能力最强的菌株。具体实施方式下面举实施例说明本专利技术，但本专利技术并不限于下述实施例。1.菌株筛选方法(1)基础盐培养基(MM)制备硫酸铵1.5g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，氯化钠0.5g，硫酸镁40.2g，吐温-802g，去离子水1000mL，pH7.5，121℃灭菌15min。(2)菌样采集自农药生产厂的排污口取污泥样约200g。(3)驯化称取菌样5.0g，置于30mL3-苯氧基苯甲酸浓度为100μg/mL的MM培养基中，30℃、180r/min振荡培养7d。再按5.0％(v/v)的接种量将培养液转入30mL3-苯氧基苯甲酸浓度为200μg/mL的MM培养基中，30℃、180r/min振荡培养7d。重复此操作，依次于3-苯氧基苯甲酸浓度为300μg/mL和500μg/mL的MM培养基中继代培养。(4)初筛将最后一级的驯化培养液按5.0％(v/v)接种量转入3-苯氧基苯甲酸浓度为100μg/mL的MM培养基中，30℃、180r/min振荡培养72h，采用HPLC法测定培养液中3-苯氧基苯甲酸的浓度，计算其降解率，依此初筛出对3-苯氧基苯甲酸有一定降解能力的菌株。(5)分离纯化将初筛获得菌样培养液进行适当稀释，涂布于3-苯氧基苯甲酸浓度为100μg/mL的MM培养基上，30℃培养72h，挑取单个菌落进行多次平板划线分离，直至得到纯化菌株。(6)复筛分别将纯化菌株接种于3-苯氧基苯甲酸浓度为100μg/mL的MM培养基中，30℃、180r/min振荡培养72h，采用HPLC法测定培养液中3-苯氧基苯甲酸的浓度，计算其降解率，依此复筛出对3-苯氧基苯甲酸具有较高降解能力的菌株。2.菌株鉴定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版，对菌株的形态学和生理生化指标进行鉴定，并对菌株的16SrDNA进行其系统发育学特征分析，构建系统进化树，确定其分类学地位。(1)形态特征菌落呈无色透明，边缘整齐，表面湿润；单个菌体为杆状，革兰氏阴性，无芽孢。(2)生理生化特征需氧生长，葡萄糖和甘油发酵均呈阳性，产酸产气，不水解明胶和淀粉，生长不需要氯化钠和氯化钾，苯丙氨酸脱氨酶阳性。(3)16SrDNA基因测序及进化树构建对该菌株的16SrDNA基因进行PCR扩增，所得PCR产物经试剂盒纯化后测序；测序结果表明，该菌株的16SrDNA基因片段长1451bp，将其在GenBank数据库中注册，得到登录号为JN857975；根据该菌株的16SrDNA基因序列，选取GenBank数据库中与其相似性达99％以上菌株的16SrDNA基因序列，运用邻近法构建系统发育树，如图1。通过在GenBank数据库中比对部分降解菌株的16SrDNA基因序列，发现与Sphingomonassp.JQ1-11(DQ132883)相似性最高，达99％；根据其亲缘关系，结合生理生化特征，确定该菌株为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)，将其命名为鞘氨醇单胞菌SC-1(Sphingomonassp.SC-1)；该菌株与其它几株Sphingomonas具有相似的系统发育关系。3.3-苯氧基苯甲酸的降解鞘氨醇单胞菌SC-1能以3-苯氧基苯甲酸作为唯一碳源和能源生长。该菌株降解3-苯氧基苯甲酸的培养基组成(w/v)为硫酸铵0.15％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钾0.15％、吐温-800.2％、硫酸镁0.02％、氯化钠0.05％；培养条件为培养基初始pH7.0-7.5、接种量5.0％(v/v)、装液量30mL/250mL锥形瓶、培养温度35℃、摇床转速180r/min、培养时间24h；上述条件下该菌株对培养基中浓度为300μg/mL、500μg/mL、700μg/mL的3-苯氧基苯甲酸的降解率分别为100％、65.79％、33.13％。附图说明图1鞘氨醇单胞菌SC-1系统发育树。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株3‑苯氧基苯甲酸降解菌，其特征在于该菌株的分类名称为鞘氨醇单胞菌SC‑1（Sphingomonas sp. SC‑1），于2016年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO：M 2016270，该菌株16S rDNA的GenBank登录号为JN857975。

【技术特征摘要】
1.一株3-苯氧基苯甲酸降解菌，其特征在于该菌株的分类名称为鞘氨醇单胞菌SC-1（Sphingomonassp.SC-1），于2016年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCNO：M2016270，该菌株16SrDNA的GenBank登录号为JN857975。2.根据权利要求1所述的3-苯氧基苯甲酸降解菌，其特征在于该菌株菌落无色透明，边缘整齐，表面湿润；单个菌体为杆状，革兰氏阴性，无芽孢；葡萄糖和甘油发酵均呈阳性，产酸产气；不水解明胶和淀粉；生长不需要氯化钠和氯化钾；苯丙氨酸脱氨酶阳性；需氧生长。3.根据权利要求1所述的3-苯氧基苯甲酸降解菌，其特征在于该菌株来源于农药厂污泥，经3-苯氧基苯甲酸浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚开，黄雨婷，贾冬英，赵甲元，迟原龙，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51