一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，属于微生物技术领域。该方法包括以下步骤：1)以样品宏基因组DNA为模板，利用引物对BSHL/BSHR进行PCR扩增，筛选出具有BSH基因的样品；2)以上述样品为分离对象，纯化得到疑似植物乳杆菌的菌株；3)以菌株基因组DNA为模板，利用引物对BSHL/BSHR进行PCR扩增，筛选得到具有BSH基因的疑似菌株；4)取上述菌株进行分子鉴定，筛选得到产胆盐水解酶的植物乳杆菌。该方法通过第一步宏基因组特异性片段的扩增，就能将绝大多数不含产BSH的植物乳杆菌样品滤除，避免了盲目筛选，大大缩小了筛选范围，具有定向、快速、简便、工作量小等特点。

A directed rapid screening method for Lactobacillus producing Lactobacillus cholera

The invention discloses a directed rapid screening method for producing brine lyase Lactobacillus plantarum, belonging to the field of microorganism technology. The method includes the following steps: 1) take the sample macrogenome DNA as the template, use primers to PCR amplification of BSHL/BSHR, select samples with BSH gene, 2) take the above sample as the separation object, and purify the strain of the suspected Lactobacillus plant, 3) take the genomic DNA as the template, and use the primers to expand the PCR by PCR. A suspected strain with BSH gene was obtained through screening and screening. 4) the above strains were identified by molecular identification, and the Lactobacillus plantarum producing choline hydrolase was screened. This method can be used to filter the most of the BSH - free Lactobacillus samples by the first step of the specific fragment of the macrogenome. It avoids the blind screening and greatly reduces the screening range. It has the characteristics of directional, rapid, simple, and small workload.

【技术实现步骤摘要】
一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法
本专利技术涉及一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，属于微生物

技术介绍
近几十年来，心血管疾病成为了全人类死亡的首要原因。临床试验表明，血清胆固醇水平过高是引起心血管疾病的主要致病性因素。当机体超过血清胆固醇水平的正常值(0～5.2mmo/L)时就表现为高胆固醇，而导致机体罹患肾病、心脏疾病、脑中风等。机体内胆固醇水平每增加1％，将会使心血管疾病的患病风险增加35％。调查发现，2012年全球范围内由心血管疾病导致的死亡人数(大约1750万)占全人类死亡总数的31％左右，其中近42％的人死于冠心病，而近38％的人死于脑中风。血清低密度脂蛋白(lowdensithlipoproteincholesterol，LDL-C)、极低密度脂蛋白(verylowdensitylipoproteincholesterol，VLDL-C)和甘油三脂(triglyceride，TG)含量的升高，以及高密度脂蛋白(Highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C)水平的降低与动脉硬化之间存在紧密的关系。流行病学调查表明，HDL-C水平每增加0.01μg/L，患心血管疾病的风险将降低3％。Bruckert等调查研究了在8545名欧洲血脂异常患者由较低HDL-C水平引起的患病率，当男性血清HDL-C低于1.03mmol/L时，其患病率为33％，当女性HDL-C低于1.29mmol/L时，其患病率为40％。探求一种相对安全、毒害小且便于人们使用的预防高胆固醇血症的方法势在必行。对于高血脂症，目前较成熟的防治对策主要包括以下几种：1)饮食疗法：摄入胆固醇含量少的食物，不吃动物内脏、蛋黄、荤油等富含胆固醇的食物；2)适量运动：运动能增加机体脂质消耗，同时加快血清中LDL-C和TG的分解和排泄；3)药物治疗：服用洛伐他汀、莫那可林、普伐他汀等药物，但由于目前尚缺乏理想的降血脂药物，且大部分药物花费较高、疗效短暂、有副作用，所以药物疗法并非首选方法；4)物理和化学方法：如溶剂提取、蒸馏、萃取等；5)生物方法：利用微生物直接或间接降解食物或体内的胆固醇水平，如乳酸菌能降低机体胆固醇水平。国外关于乳酸菌降胆固醇作用的研究起步较早。最初，Mann等对长期饮用乳酸菌发酵制品的非洲Maasai部落进行研究发现其体内胆固醇水平较低，且进一步研究发现长期饮用酸奶和其他乳制品的美国人体内胆固醇水平也较低。这些结果引起国内外研究者的广泛关注，引发了对乳酸菌降胆固醇作用的研究热潮。Gilliland等分离筛选出一株嗜酸乳杆菌，该菌株能降低培养基中胆固醇的浓度。Salaj等发现植物乳杆菌LS/07能降低大鼠血清TC和LDL-C水平，而植物乳杆菌BiocenolLP96能降低TG和VLDL水平，但同时不改变血清高密度脂蛋白和肝脏脂质水平。Tomaro-Duchesneau等对11株乳酸菌的胆固醇同化作用进行了研究，在MRS肉汤培养基中L.plantarumATCC14917同化胆固醇能力最高，达到15.18±0.55mg/1010cfu，而体外模拟肠道环境条件下L.reuteriNCIMB701089同化胆固醇能力最高，达到2254.70±63.33mg/1010cfu。Singh等从哺乳期的婴儿粪便中分离出L.reuteriLR6，经体内外试验发现该菌株不仅具有降胆固醇能力，还表现出BSH活性。相对于国外，国内关于乳酸菌降胆固醇作用的研究起步较晚。2003年，肖琳琳等从藏灵菇中成功分离出1株体外胆固醇降解率高达51.8％的干酪乳杆菌KM-16，通过对高脂模型小鼠为期14d的灌胃处理发现，该菌株能显著降低小鼠机体内TC水平。Liu等研究了乳酸菌在不同浓度胆固醇条件下的降解效果，结果显示在较低浓度胆固醇条件下，乳酸菌的胆固醇降解率随浓度的增大先升高后降低，当胆固醇浓度为1mg/mL时，降解效果最好，而当胆固醇高于该浓度时，降解率均表现为降低，这可能源于胆固醇浓度过高时抑制乳酸菌生长的作用。Li等通过构建SD大鼠高血脂症模型评估了L.plantarumNCU116的体内降胆固醇效果，结果发现该菌株能通过调控与低密度脂蛋白受体和胆固醇7α-羟化酶相关关键因子的基因表达，改变大鼠脂质的代谢并降低机体内胆固醇含量。Wang等共分离筛选出50株乳酸菌，其中乳酸片球菌B0006、植物乳杆菌B0007和B0022均表现显著的胆固醇降解能力，并显示不同程度的酸和胆盐耐受性，同时植物乳杆菌B0007和B0022对Caco-2细胞系有一定的粘附性。Chen等研究发现鼠李糖乳杆菌hsryfm1301及其发酵乳不但能改善大鼠肠道微生物构成，而且能显著降低大鼠体内胆固醇含量。目前，具有降胆固醇潜能的乳酸菌的初筛方法通常有以下几种：1)常规方法，即从食品、人或动物肠道内容物中分离纯化出革兰氏阳性(G+)且接触酶阴性的菌株，接种至含胆固醇的培养基中培养，通过OPA、比色法等测定培养基中胆固醇水平，判定该菌株是否有胆固醇降解能力；2)指示剂法，即将分离纯化后的乳酸菌接种至含溴麝香草酚蓝的改良kenji培养基中，根据培养基的变色速度确定菌株降胆固醇能力；3)Ca2+沉淀法，由于部分乳酸菌具有BSH活性，水解产生的游离性胆酸能与Ca2+形成沉钙圈，通过测定沉钙圈大小来判定乳酸菌是否具有胆固醇降解能力。通过比较发现，方法1)的操作较为繁琐，需要对分离纯化出的每个菌株进行降胆固醇能力测试，但不会出现遗漏现象，而后两种方法虽操作简便，但都必不可少地要先将乳酸菌分离纯化出来，再通过指示剂法或钙沉淀法筛选具有降胆固醇能力的乳酸菌，前期分离工作量较大，且分离出来的乳酸菌不一定具有降胆固醇能力，所以前期工作绝大部分是无用功，同时还可能将目的菌株甚至是强降解效果的乳酸菌漏掉。因此，上述三种方法都不能称之为卓尔有效。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，包括以下步骤：1)以样品宏基因组DNA为模板，利用引物对BSHL/BSHR进行PCR扩增，筛选出具有BSH基因的样品；2)以上述样品为分离对象，纯化得到疑似植物乳杆菌的菌株；3)以菌株基因组DNA为模板，利用引物对BSHL/BSHR进行PCR扩增，筛选得到具有BSH基因的疑似植物乳杆菌菌株；4)取上述菌株进行分子鉴定，筛选得到产胆盐水解酶的植物乳杆菌。步骤1)、3)中引物对BSHL/BSHR为：BSHL：5’-AACTGCAGATGTGTGTACTGCCATAACT-3’；BSHR：5’-GGAATTCTTAGTTAACTGCATAGTATTGTG-3’。步骤1)、3)中PCR扩增的反应体系为：10×PCRbuffer2.5μL，25mmol/LdNTPs2.0μL，5U/μLDNAPolymerase0.5μL，20pmol/L引物BSHL、BSHR各0.5μL，75mg/L模板0.5μL，超纯水18.5，总计25.0μL。步骤1)、3)中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸90本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)以样品宏基因组DNA为模板，利用引物对BSHL/BSHR进行PCR扩增，筛选出具有BSH基因的样品；2)以上述样品为分离对象，纯化得到疑似植物乳杆菌的菌株；3)以菌株基因组DNA为模板，利用引物对BSHL/BSHR进行PCR扩增，筛选得到具有BSH基因的疑似植物乳杆菌菌株；4)取上述菌株进行分子鉴定，筛选得到产胆盐水解酶的植物乳杆菌；步骤1)、3)中引物对BSHL/BSHR为：BSHL：5’‑AACTGCAGATGTGTGTACTGCCATAACT‑3’；BSHR：5’‑GGAATTCTTAGTTAACTGCATAGTATTGTG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种定向快速筛选产胆盐水解酶植物乳杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)以样品宏基因组DNA为模板，利用引物对BSHL/BSHR进行PCR扩增，筛选出具有BSH基因的样品；2)以上述样品为分离对象，纯化得到疑似植物乳杆菌的菌株；3)以菌株基因组DNA为模板，利用引物对BSHL/BSHR进行PCR扩增，筛选得到具有BSH基因的疑似植物乳杆菌菌株；4)取上述菌株进行分子鉴定，筛选得到产胆盐水解酶的植物乳杆菌；步骤1)、3)中引物对BSHL/BSHR为：BSHL：5’-AACTGCAGATGTGTGTACTGCCATAACT-3’；BSHR：5’-GGAATTCTTAGTTAACTGCATAGTATTGTG-3’。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)、3)中PCR扩增的反应体系为：10×PCRbuffer2.5μL，25mmol/LdNTPs2.0μL，5U/μLDNAPolymerase0.5μL，20pmol/L引物BSHL、BSHR各0.5μL，75mg/L模板0.5μL，超纯水18.5，总计25.0μL。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃延伸10min。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤1)、3)中PCR扩增得到990bp的基因片段，即为具有BSH基因。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中纯化采用含牛磺胆酸钠的MRS培养基，组成为：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母浸粉0.5g、吐温-800.1mL、葡萄糖2.0g、磷酸氢二钾0.2g、柠檬酸二铵0.2g、乙酸钠0.5g、硫酸镁0.058g、硫酸锰0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁轲，陈亚茹，刘炜，余祖华，李旺，李元晓，何万领，曹平华，赵龙妹，王玉琴，张春杰，程相朝，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南,41