用于生产具有IGG FC结构域的融合蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于制备具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，具体涉及一种用于制备具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，所述方法另外包含在降低的培养温度下培养生产融合蛋白的细胞的步骤，由此增加细胞生长和细胞活力，从而增加融合蛋白生产率并抑制聚集体生成，进而提高质量和产量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产具有IGGFC结构域的融合蛋白的方法
本申请要求分别于2015年10月15日和2016年10月13日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2015-0144330号和第10-2016-0132633号的优先权和权益，其公开内容通过引用整体并入本文。本专利技术涉及一种用于生产具有人免疫球蛋白G(IgG)Fc结构域的融合蛋白的方法，所述融合蛋白特别是其中血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域与人免疫球蛋白G(IgG)Fc结构域融合的蛋白(例如，阿柏西普)。
技术介绍
血管内皮生长因子(VEGF)是增加血管生成和血管通透性的重要因子。特别地，VEGF在肿瘤细胞中过表达，因此促进异常的血管生成和肿瘤增殖(Oncogene，2004,23,1745-1753)。此外，据报道，除了肿瘤发生之外，异常的血管生成与其它疾病重要地相关。在通过VEGF的机制中，异常的血管生成与眼科疾病的湿性黄斑变性、糖尿病性视网膜病和视网膜静脉阻塞性黄斑水肿等有关(J.KoreanMed.Assoc.,2014，57，7，614-623)。作为这些眼科疾病的治疗剂，已经使用了哌加他尼钠(pegaptanib，RNA适体)、雷珠单抗(ranibizumab，单克隆IgG抗体片段(Fab))和贝伐单抗(bevacizumab，单克隆IgG抗体)，并且在2011年，阿柏西普(与IgG1Fc融合的VEGFR1和VEGFR2)在美国被批准作为用于湿性黄斑变性的治疗剂(Biol.Ther.,2012，2，3，1-22；DrugDesignDevelopmentTherapy,2013，3，7，711-722)。由于对这些治疗性重组蛋白的需求日益增加，通过改进细胞选择，培养基优化和培养过程控制，已经做出了许多努力来改善细胞生长、活力和蛋白生产和质量。通过细胞培养产生的许多蛋白和多肽是由通过在预定温度或pH下使用分批或补料分批方法培养细胞预定时间，然后分离细胞以生产细胞的方法而制得的。因此，产量和质量可能受细胞培养条件的影响。需要一种能够通过调节和优化与蛋白生产相关的细胞培养条件而增加所产生的蛋白量，抑制错误折叠/聚集蛋白的生成，或抑制蛋白的脱酰胺化体或所生成的取代/缺失的氨基酸衍生物来预防动物细胞培养物中安全问题的方法(例如免疫原性和纯化过程的并发症)。
技术实现思路
技术问题为了解决上述问题而设计了本专利技术，并提供了用于增加蛋白表达水平的IgGFc融合蛋白的生产方法。本专利技术的另一个目的是提供一种用于制备靶标蛋白的方法，该方法包括：通过上述生产方法培养生产靶标蛋白的细胞。本专利技术的另一个目的是提供一种药物组合物，其包括通过上述制备方法制备的治疗性蛋白和药学上可接受的载体。然而，本专利技术要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员可以从以下描述中清楚地理解未提及的其它问题。技术方案为了解决上述问题，证实了本专利技术通过优化产生融合蛋白的细胞的培养条件以提高具有IgGFc结构域的融合蛋白的生产率和质量。具体而言，证实了通过在典型的培养温度(35.0℃至38.0℃)下培养细胞预定时间，然后在28.0℃至35.0℃的降低培养温度下培养细胞，增加了融合蛋白的生产率，并抑制了融合蛋白聚集体的生成，基于该事实完成了本专利技术。为了实现这些目的，本专利技术提供了一种用于生产其中血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域与人免疫球蛋白G(IgG)Fc结构域融合的蛋白的方法，其中，在28.0℃或更高且低于35.0℃的降低温度下培养细胞以提高融合蛋白的表达水平。根据本专利技术的优选示例性实施方式，通过该方法制备的融合蛋白可以是聚集体减少的融合蛋白。根据本专利技术的优选示例性实施方式，细胞培养可以是大规模细胞培养。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，细胞培养可以是选自由分批培养、重复分批培养、补料分批培养、重复补料分批培养、连续培养和灌注培养组成的组中的任一种。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，细胞培养可以是补料分批细胞培养。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，细胞可以是哺乳动物细胞。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，哺乳动物细胞可以是CHO细胞。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，CHO细胞可以是选自由DG44、DXB-11、K-1和CHO-S组成的组中的任一种的细胞系。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，从培养起始日至温度变化的培养温度可以是包含在33.0℃至小于38.0℃的温度范围内的温度。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，温度可以降低至30.0℃至34.0℃。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，从培养起始日至温度变化的培养周期可以是1至5天。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，温度降低后的培养周期可以是2至15天。根据本专利技术的另一种示例性实施方式，在权利要求1中，温度变化前的培养周期和温度变化后的培养周期之和可以为3天或更多。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，VEGF受体的可溶性细胞外结构域可以包括第一VEGF受体的免疫球蛋白样结构域2和第二VEGF受体的免疫球蛋白样结构域3。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，所生产的蛋白可以是治疗性蛋白。本专利技术还提供了一种用于制备靶标蛋白的方法，该方法包括：通过上述生产方法培养生产靶标蛋白的细胞。根据本专利技术的一种优选的示例性实施方式，该方法可以另外包括从其中培养生产靶标蛋白的细胞的培养肉汤中回收靶标蛋白的过程。根据本专利技术的另一种优选的示例性实施方式，靶标蛋白可以是治疗性蛋白。本专利技术还提供了一种药物组合物，其包括通过上述制备方法制备的治疗性蛋白和药学上可接受的载体。然而，本专利技术要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员可以从以下描述中清楚地理解未提及的其它问题。有益效果通过另外包括在降低的培养温度下培养生产具有IgGFc结构域的融合蛋白的细胞的步骤，本专利技术增加了细胞生长和细胞活力，增加融合蛋白的表达水平，并抑制聚集体产生，因此增加了融合蛋白的生产率并提高了质量，使得可以大量制备和提供融合蛋白。附图说明图1是根据产生阿柏西普的细胞的培养温度分析细胞生长和细胞活力变化的图。图2是显示随着时间(X轴；培养时间[天])产生阿柏西普的累积活细胞数(Y轴；IVC[归一化109细胞×天/L])且归一化为IVC的图。图3是显示根据产生阿柏西普的细胞的培养温度的比生产率变化的图。图4是通过高效液相色谱法(HPLC)根据产生阿柏西普的细胞的培养温度分析表达水平变化的图。图5是根据产生阿柏西普的细胞的低培养温度分析细胞生长和细胞活力变化的图。图6是通过HPLC根据产生阿柏西普的细胞的低培养温度分析表达水平变化的图。图7是在2L生物反应器中根据产生阿柏西普的细胞的培养温度分析细胞生长和细胞活力变化的图。图8是显示在2L生物反应器中随着时间(X轴；培养时间[天])产生阿柏西普的累积活细胞数(Y轴；IVC[归一化109细胞×天/L])且归一化为IVC的图。图9是显示在2L生物反应器中根据产生阿柏西普的细胞的培养温度的比生产率变化的图。图10是通过蛋白A-HPLC在2L生物反应器中根据产生阿柏西普的细胞的培养温度分析表达水平变化的图。图11是通过高效液相凝胶色谱法(SE-HPLC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产其中血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域与人免疫球蛋白G(IgG)Fc结构域融合的蛋白的方法，其中，在28.0℃或更高且低于35.0℃的降低温度下培养细胞以提高所述蛋白的表达水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.15 KR 10-2015-0144330;2016.10.13 KR 10-2011.一种用于生产其中血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域与人免疫球蛋白G(IgG)Fc结构域融合的蛋白的方法，其中，在28.0℃或更高且低于35.0℃的降低温度下培养细胞以提高所述蛋白的表达水平。2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过所述方法制备的蛋白是聚集体的量减少的蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞培养是大规模细胞培养。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述细胞培养是选自由分批培养，重复分批培养、补料分批培养、重复补料分批培养、连续培养和灌注培养组成的组中的任一种或多种。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述细胞培养是补料分批细胞培养。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。8.根据权利要求7所述的方法，其中，CHO细胞是选自由DG44、DXB-11、K-1和CHO-S组成的组中的任一种的细胞系。9.根据权利要求1所述的方法，其中，从培养起始日至温度变化的培养温度是包含在33.0℃至小于...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴淳宰，郑惠信，柳善儿，赵正秀，
申请(专利权)人：阿特根公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR