针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法技术

本发明专利技术公开了一种针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法：以色氨酸或含有色氨酸残基的物质作为被修饰物，于水中，在醛组分的作用下芳伯胺修饰剂与被修饰物中的色氨酸/色氨酸残基发生高选择性三组分亲电取代反应，从而将芳伯胺修饰剂分子以共价键牢固连接在色氨酸/色氨酸残基上。该化学修饰方法中，芳伯胺修饰剂对蛋白质中的色氨酸及其残基具有优异的选择性，对其他活泼氨基酸及其残基无显著反应性；伯胺修饰剂分子与色氨酸及其残基之间形成共价键合，耐久性优异。

Highly selective chemical modification of tryptophan and its residues

The present invention discloses a highly selective chemical modification method for tryptophan and its residues: in water, the aromatic amines modifier and tryptophan / tryptophan residues in the modifier are highly selective three component electrophilic substitutions under the action of the aldehyde component in water. Thus, the aromatic amine modifier molecules are covalently bonded to tryptophan / tryptophan residues covalently. In this chemical modification, the aromatic amines modifier has excellent selectivity for tryptophan and its residues in protein, and has no significant reactivity to other active amino acids and their residues; the modifier of primary amine modifies the covalent bond between tryptophan and its residues and has excellent durability.

【技术实现步骤摘要】
针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法
本专利技术涉及一种针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法。
技术介绍
蛋白质化学修饰技术是现代生物技术发展的一个重要方向。凡是通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白质的化学修饰。化学修饰是研究蛋白质结构和功能关系的一种重要手段，也是定向改造蛋白质性质的一种有力工具。蛋白质的化学修饰方法主要有两种：(1)改变蛋白质分子的侧链基团；(2)改变蛋白质分子的主链结构。其中，针对蛋白质中氨基酸残基的侧链结构进行修饰的反应是简便、高效的化学修饰手段，利用该手段能够改造蛋白质分子的性质，如使其激活、失活，或者赋予功能性、提高稳定性等。蛋白质是生命的物质基础，是生命活动的主要承担者。蛋白质分子具有错综复杂的三维结构，而它的所有氨基酸残基的侧链基团分布于蛋白质分子的各个部分。有的残基处于蛋白质分子的表面，易于受到试剂的进攻和作用，有的残基内埋于蛋白质分子的疏水内环境中，不易与试剂接触和反应。此外，处于不同的研究目的，对化学修饰反应发生的部位也有一定的要求。因此，针对蛋白质结构中某种氨基酸残基的高选择性化学修饰方法成为当前的研究热点。蛋白质通常是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，在众多的氨基酸残基中，色氨酸、酪氨酸和组氨酸残基由于存在芳环或杂环结构，电子云密度较高，容易受到亲电试剂的进攻，发生亲电取代反应，实现化学修饰。例如，色氨酸、酪氨酸和组氨酸残基均能够与重氮盐反应，说明重氮盐等强亲电性试剂对活泼氨基酸具有良好的反应性，但选择性欠佳，难以实现对特定氨基酸残基位点的化学修饰。专利技术CN201310737395.9公开了一种适用于蚕丝的共价键着色方法：含芳伯胺基团的染料在醛类物质的作用下与蚕丝中的酪氨酸残基发生Mannich反应；所述含芳伯胺基团的染料与蚕丝的质量比为0.005～0.03：1，所述含芳伯胺基团的染料与醛类物质的摩尔为1：1～2；染色浴比为1：20～100；染浴pH值保持在4.0～6.5，染色温度为30～70℃，保温时间0.5～24小时；该专利芳伯胺染料反应位点为蚕丝中的酪氨酸残基。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法：以色氨酸或含有色氨酸残基的物质作为被修饰物，于水中，在醛组分的作用下芳伯胺修饰剂(含芳伯胺基团的修饰剂，简称芳伯胺修饰剂)与被修饰物中的色氨酸/色氨酸残基发生高选择性三组分亲电取代反应，从而将芳伯胺修饰剂分子以共价键牢固连接在色氨酸/色氨酸残基上。作为本专利技术的针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法的改进：所述芳伯胺修饰剂与色氨酸/色氨酸残基的摩尔比为0.1～10：1，芳伯胺修饰剂与醛组分的摩尔比为1：3～100；调节整个反应体系的pH值为4.0～6.5，于20～60℃保温反应1～24小时；反应所得产物经洗涤后干燥。作为本专利技术的针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法的进一步改进：水与芳伯胺修饰剂的质量比为20～7000：1。作为本专利技术的针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法的进一步改进：所述芳伯胺修饰剂的结构中至少需要存在一个芳伯胺片段。作为本专利技术的针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法的进一步改进，所述芳伯胺修饰剂为以下任意一种：苯胺、萘胺、苯胺衍生物、萘胺衍生物；所述苯胺衍生物为对甲基苯胺、对乙酰氨基苯胺、对甲氧基苯胺、芳伯胺染料C.I.酸性棕4、C.I.酸性绿20。作为本专利技术的针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法的进一步改进：所述醛组分为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、丙酮醛、戊二醛或苯甲醛。作为本专利技术的针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法的进一步改进：被修饰物为色氨酸、含有色氨酸残基的多肽A、含色氨酸残基的蛋白质(例如为含有色氨酸残基的桑蚕丝)。在本专利技术中，用醋酸-醋酸钠的缓冲溶液来调节上述pH值。反应结束后，调节pH值至5.0，产物析出、过滤后，洗涤、晾干(在室温下晾至恒重)。本专利技术利用芳伯胺修饰剂、醛组分和色氨酸及其残基的三组分反应将芳伯胺修饰剂与色氨酸及其残基通过C-N桥基共价键合，是一种针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法。其反应式可能如下所示：本专利技术中所述芳伯胺修饰剂反应位点为色氨酸及其残基，酪氨酸及其残基实验证实在此条件下不发生反应。用本专利技术所提供的化学修饰方法对蛋白质进行修饰具有如下技术优势：(1)该化学修饰方法中芳伯胺修饰剂对蛋白质中的色氨酸及其残基具有优异的选择性，对其他活泼氨基酸及其残基无显著反应性；(2)芳伯胺修饰剂分子与色氨酸及其残基之间形成共价键合，耐久性优异；(3)可在室温、弱酸条件下对蛋白质进行化学修饰，对蛋白质性质影响较小。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。实施例1、一种针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法，选用芳伯胺染料C.I.酸性棕4作为芳伯胺修饰剂，甲醛作为醛组分，色氨酸、酪氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸共十种活性较高的氨基酸分别作为被修饰物。化学修饰方法具体如下：选用37％(质量％)的甲醛水溶液。将C.I.酸性棕4、氨基酸、甲醛(水溶液)按摩尔比1：1：100混合，此时，水与芳伯胺修饰剂的质量比约为50：1；反应液pH值调节为4.0(用3.6mL1mol/L的醋酸钠与16.4mL1mol/L的醋酸配制而成，此为常规技术)，反应温度为30℃，保温时间24小时。反应结束后，调节pH值至5.0，产物析出、过滤、洗涤(用清水洗涤至洗脱液为中性)、晾干。仅仅当色氨酸作为被修饰物时，所得产物为棕色，即，仅仅色氨酸作为被修饰物能够获得三组分反应产物，而其他氨基酸与C.I.酸性棕4无反应现象(经薄层色谱和质谱法证实)，说明该化学修饰方法对色氨酸具有高选择性，芳伯胺修饰剂和色氨酸之间形成共价键合。对比例1-1、取消实施例1中的甲醛的使用，其余等同于实施例1，最终所得的结果为：C.I.酸性棕4与色氨酸之间未发生化学反应。对比例1-2、将C.I.酸性棕4、氨基酸、甲醛(水溶液)按摩尔比1：1：2进行混合；其余等同于实施例1。最终所得的结果为：C.I.酸性棕4与色氨酸之间未发生化学反应。实施例2、一种针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法，选用对甲基苯胺作为芳伯胺修饰剂，醛组分选用乙醛，含有色氨酸残基的多肽A(氨基酸序列为Tyr-Glu-Tyr-Ala-Trp-Ser-Ser，其中Trp为色氨酸，Tyr为酪氨酸，Glu为谷氨酸，Ala为丙氨酸，Ser为丝氨酸)作为被修饰物。化学修饰方法具体如下：0.007mmol多肽A与0.05mmol(5.35mg)的对甲基苯胺和0.15mmol的乙醛；反应体系中水为35mL；pH值为4.5，反应温度为37℃，保温时间22小时。反应结束后，经过热水和冷水洗涤(经过60℃和15℃的去离子水洗涤10h)，从而除去吸附在多肽上的杂质，过滤、洗涤(用清水洗涤至洗脱液为中性)、晾干。分析结果表明，一个对甲基苯胺分子通过C-N桥基连接到色氨酸及其残基上，修饰率达到75％，说明该化学修饰方法对多肽结构中的色氨酸及其残基同样具有良本文档来自技高网...

【技术保护点】
针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法，其特征是：以色氨酸或含有色氨酸残基的物质作为被修饰物，于水中，在醛组分的作用下芳伯胺修饰剂与被修饰物中的色氨酸/色氨酸残基发生高选择性三组分亲电取代反应，从而将芳伯胺修饰剂分子以共价键牢固连接在色氨酸/色氨酸残基上。

【技术特征摘要】
1.针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法，其特征是：以色氨酸或含有色氨酸残基的物质作为被修饰物，于水中，在醛组分的作用下芳伯胺修饰剂与被修饰物中的色氨酸/色氨酸残基发生高选择性三组分亲电取代反应，从而将芳伯胺修饰剂分子以共价键牢固连接在色氨酸/色氨酸残基上。2.根据权利要求1所述的针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法，其特征是：所述芳伯胺修饰剂与色氨酸/色氨酸残基的摩尔比为0.1～10：1，芳伯胺修饰剂与醛组分的摩尔比为1：3～100；调节整个反应体系的pH值为4.0～6.5，于20～60℃保温反应1～24小时；反应所得产物经洗涤后干燥。3.根据权利要求2所述的针对色氨酸及其残基的高选择性化学修饰方法，其特征是：水与芳伯胺修饰剂的质量比为20～7000：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈维国，崔志华，江华，高普，赵玲，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33