人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法技术

本发明专利技术提供一种人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，先采集粪便样本并进行预处理，其间加入RNA提取液，且预处理完成获得待测样液。接下来设定引物序列，并使用对应的引物配制反应体系，充分混匀后分装并顺序加入RNA样本核酸2μL，盖紧反应管管盖，瞬离使液体集中在管底。最终使用荧光定量PCR仪进行恒温反应，并设置反应温度为60‑65℃，时长1min，重复30‑60个循环，于60‑65℃每分钟末收集荧光信号，并判读结果。如此，有效缩短了检测时间。

【技术实现步骤摘要】
人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法
本专利技术属于体外诊断试剂领域，具体涉及一种人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法。
技术介绍
肠道病毒71型为小RNA病毒科，肠道病毒属。1974年首次报道从美国具有中枢神经系统症状患者标本中分离到EV71，此后EV71的流行范围遍及全球。目前，人类是EV71唯一已知的自然宿主，病毒主要通过人群间的密切接触传播，可经过被感染者的口鼻分泌物、粪便和飞沫等传播。人群对EV71普遍易感，以婴幼儿和低龄儿童感染为主。该病流行期间，可发生幼儿园集体感染和家庭聚集发病现象，而且传染性强、传播速度快、传播途径复杂，短时间内可造成较大范围的流行，疫情控制难度大。因此，快速特异的检测方法尤为重要，特别是对EV71感染引起的重症病例的检测。对于EV71，目前的实验室检测方法主要包括细胞培养进行病毒分离、血清学抗体、RT-PCR、ReaL-timePCR等。但上述方法均存在不足：细胞培养繁杂耗时,血清学检测时肠道病毒的抗原交叉反应等问题,不适合早期应急诊断；RT-PCR技术是目前最为快速有效的检测方法之一,但其检测时间仍需6-7h,扩增后还需电泳进行特异条带比对,无法做到简便快速；ReaL-timePCR从敏感性、特异性与速度上都具有一定优势,但是检测成本较高,不太适用于临床标本检测。鉴于以上原因，需要提供一种耗时短、成本低且准确率高的核酸检测方法，用于人类肠道病毒71型感染的辅助诊断。
技术实现思路
本专利技术提供一种人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法。为更好的帮助理解本专利技术，下面对相关概念作出阐述。环介导等温扩增技术是2000年建立的一种新的核酸扩增方法。其原理是利用一种链置换DNA聚合酶和两对特殊的引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。反应结果可直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断，也可以由添加SYBRGreenI、嗅化乙啶或其它核酸染剂进行呈色后观察。但由于该技术扩增效率高，反应灵敏，通过显色反应容易导致污染，且污染不易消除。本专利技术将环介导等温扩增技术与荧光PCR进行结合，扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号，通过检测仪器实时读取荧光信号，根据扩增曲线判读结果，从而实现对样本中肠道病毒71型的测定。该检测方法较PCR荧光探针法，操作简单，反应速度快，且避免了人为观察结果造成的误差。检测试剂为预混反应液，免分装，进一步简化操作步骤并且仪器不要求进行变温循环，更适用于基层临床应用及推广。本专利技术提供的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，包括步骤S1-S3。步骤S1：采集粪便样本并进行预处理，其间加入RNA提取液，且预处理完成获得待测样液。步骤S2：设定引物序列，并使用对应的引物配制反应体系，充分混匀后分装并顺序加入RNA样本核酸2μL，盖紧反应管管盖，瞬离使液体集中在管底。步骤S3：使用荧光定量PCR仪进行恒温反应，并设置反应温度为60-65℃，时长1min，重复30-60个循环，于60-65℃每分钟末收集荧光信号，并判读结果。优选的，步骤S1分解为步骤S11-S14。步骤S11：取液态样本各100μL放置于1.5mL灭菌离心管，加入100-800μLTrizoL试剂及50-200μL氯仿，用振荡器震荡20s后静置3min，12000rpm离心1-5min。步骤S12：吸取上层液体转移至新的1.5mL离心管中，加入10-100μLRNA提取液，振荡混匀后8000rpm离心1min，沉淀并去除液体。步骤S13：加入100-400μL75％无水乙醇，振荡混匀后以8000rpm离心1min，沉淀并去除液体。步骤S14：将装有沉淀颗粒的离心管风干5-30min后，加入50μLDEPCH2O，移液器吹打混匀所述沉淀颗粒，得到白色的混悬液待用。优选的，所述RNA提取液包含酸性二氧化硅。优选的，在步骤S11中，液态样本是由水样粪便样本混匀，或较干粪便样本加入生理盐水得到，且不足100μL时补加生理盐水重悬。优选的，在步骤S14中，将装有沉淀颗粒的离心管风干5-30min，或用开放式加热器于60℃干燥5min。优选的，在步骤S14中，白色的混悬液直接用于检测，或存于-70℃待用。优选的，在步骤S2中，反应体系对应配比为：10XIsothermaLAmpLicationBuffer、2.5μL；dNTPMix(10mM)、3-4μL；MgSO4(100mM)、0.1-2μL；FIP/BIPPrimers(20μM)、0.5-2.5/0.5-2.5μL；F3/B3Primers(10μM)、0.1-1/0.1-1μL；LF/LBPrimers(10μM)、0.1-1/0.1-1μL；Bst2.0WarmstartDNAPoLymerase、0.1-2μL；WarmstartRTxReverseTranscriptase、0.1-2μL；EVAGreen、0.1-2μL；补充DEPCH2O至23μL。优选的，在步骤S3中，使用ABIstepone荧光定量PCR仪，且选用SYBR通道。优选的，在步骤S3中，判读结果的依据为：阳性质控呈“S”型扩增曲线，阴性质控无“S”型扩增曲线，且同一次实验两者需同时满足；若待检样本呈“S”型或不完全“S”型扩增曲线，则判样本为EV71阳性；若待检样本无“S”型扩增曲线，则判样本为EV71阴性。通过本专利技术提供的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，先采集粪便样本并进行预处理，其间加入RNA提取液，且预处理完成获得待测样液。接下来设定引物序列，并使用对应的引物配制反应体系，充分混匀后分装并顺序加入RNA样本核酸2μL，盖紧反应管管盖，瞬离使液体集中在管底。最终使用荧光定量PCR仪进行恒温反应，并设置反应温度为60-65℃，时长1min，重复30-60个循环，于60-65℃每分钟末收集荧光信号，并判读结果。如此，有效缩短了检测时间。结合附图阅读本申请实施方式的详细描述后，本申请的其他特点和优点将变得更加清楚。附图说明图1为本专利技术较佳实施例提供的荧光信号结果判读样本示例图；图2为本专利技术较佳实施例提供的荧光信号结果判读实验数据图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术提供的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，包括步骤S1-S3。步骤S1：采集粪便样本并进行预处理，其间加入RNA提取液，且预处理完成获得待测样液。具体而言，本实施例所指的样本类型为粪便样本，样本采集对象为手足口病、疱疹性咽峡炎等患者或疑似患者，特别是发病所在地的社区或托幼机构的5岁以下的儿童。采集病人发病7日内的粪便样本，粪便样本采集量为5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内。本步骤中的预处理过程由步骤S11～步骤S14组成。步骤S11：取液态样本各100μL放置于1.5mL灭菌离心管，加入100-800μLTrizoL试剂及50-200μL氯仿，用振荡器震荡20s后静置3min，12000rpm离心1-5min。于此，液态样本是由水样粪便样本混匀，或较干粪便样本加入生理盐水得到，且不足100μL时补加生理盐水重悬。步骤S12：吸取上层液体，吸取时不可触及中间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、采集粪便样本并进行预处理，其间加入RNA提取液，且预处理完成获得待测样液；S2、设定引物序列，并使用对应的引物配制反应体系，充分混匀后分装并顺序加入RNA样本核酸2μL，盖紧反应管管盖，瞬离使液体集中在管底；S3、使用荧光定量PCR仪进行恒温反应，并设置反应温度为60‑65℃，时长1min，重复30‑60个循环，于60‑65℃每分钟末收集荧光信号，并判读结果。

【技术特征摘要】
1.一种人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、采集粪便样本并进行预处理，其间加入RNA提取液，且预处理完成获得待测样液；S2、设定引物序列，并使用对应的引物配制反应体系，充分混匀后分装并顺序加入RNA样本核酸2μL，盖紧反应管管盖，瞬离使液体集中在管底；S3、使用荧光定量PCR仪进行恒温反应，并设置反应温度为60-65℃，时长1min，重复30-60个循环，于60-65℃每分钟末收集荧光信号，并判读结果。2.根据权利要求1所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，步骤S1分解为以下步骤：S11、取液态样本各100μL放置于1.5mL灭菌离心管，加入100-800μLTrizoL试剂及50-200μL氯仿，用振荡器震荡20s后静置3min，12000rpm离心1-5min；S12、吸取上层液体转移至新的1.5mL离心管中，加入10-100μLRNA提取液，振荡混匀后8000rpm离心1min，沉淀并去除液体；S13、加入100-400μL75％无水乙醇，振荡混匀后以8000rpm离心1min，沉淀并去除液体；S14、将装有沉淀颗粒的离心管风干5-30min后，加入50μLDEPCH2O，移液器吹打混匀所述沉淀颗粒，得到白色的混悬液待用。3.根据权利要求1或2所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，所述RNA提取液包含酸性二氧化硅。4.根据权利要求2所述的人类肠道病毒71型实时荧光恒温扩增核酸检测方法，其特征在于，在步骤S11中，液态样本是由水样粪便样本混匀，或较干粪便样本加入生理盐水得到，且不足100μL时补加生理盐水重悬。5.根据权利要求2所述的人类肠道病毒7...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，徐建军，阮伟，孙艳丽，曹丙春，李晋，刘万建，
申请(专利权)人：青岛汉唐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37