【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测试剂盒，尤其涉及一种适用于荧光定量pcr试剂的冻干保护剂、冻干方法及应用。
技术介绍
1、呼吸道感染是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。目前，结核病仍是全球传播最广泛、危害最严重的呼吸道传染病之一，2020年全球有约150万人因结核病死亡。世界卫生组织提出到2035年终止结核病流行的行动目标，呼吁持续加强结核病诊断、治疗、预防等领域创新，以加速结核病发病率、死亡率的下降。结核病的病原菌主要是结核分枝杆菌。甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行，主要经空气飞沫传播，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。
2、分子诊断是以dna和rna为诊断材料，应用分子生物学技术检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术。分子诊断的基本原理是通过检测dna或rna的结构是否变化、量的多少以及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。常见的分子诊断方法有核酸扩增技术、基因测序技术等。
3、核酸检测是呼吸道病原体诊断的重要参考，核酸扩增技术最常见的是荧光定量pcr技术，该技术具有检测灵敏度高、准确性高、特异性强的优点，是疾病诊断或病原体检测的首选方法，在体外诊断市场具有广阔的应用前景。但由于pcr技术高度依赖taq dna聚合酶和逆转录酶的活性，需要在低温(如-20℃)环境下进行储存和运输，一旦酶变性失活可能会
4、真空冷冻干燥技术(简称冻干)是一种能有效提升生物制品保存稳定性的方法，为防止有效成分在冻干过程中损失生物学活性，在冻干试剂里往往需要添加冻干保护剂，如甘露醇、聚乙烯吡咯烷烔(pvp)、吐温、牛血清蛋白、甘油、聚乙二醇(peg)等。
5、但这些常规的冻干保护剂在冻干操作中使用的浓度较高，往往会对不同的pcr扩增体系产生较大程度的影响，导致出现扩增效率低甚至无法扩增、荧光信号值太低、ct值影响较大等情况，故难以用作pcr试剂的冻干保护剂。因此，现有技术有待进一步改进。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供了一种适用于各类荧光定量pcr试剂的冻干保护剂、冻干方法及应用，该冻干保护剂的成分简单、使用便利、不影响试剂活性和试剂盒的检测灵敏度，其稳定性高。
2、为解决上述问题，本申请提供以下的技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种适用于荧光定量pcr试剂的冻干保护剂，其包括以下成分：聚蔗糖400、木糖醇、谷氨酸和维生素e。
4、上述冻干保护剂成分简单，配制和使用便利且制备成本低。经过实验证明，在qpcr扩增试剂和rt-qpcr扩增试剂中添加所述冻干保护剂后，扩增试剂本身性能以及酶活不受影响，且稳定性更好，可在常温下稳定存放1年，降低由于温度控制不当导致试剂活性降低的风险，因此该试剂可以进行常温运输，免除冷链储运和低温保存的成本。
5、可选地，所述荧光定量pcr试剂包括qpcr试剂、rt-qpcr试剂。
6、优选地，所述冻干保护剂包括以下成分，各成分的质量百分浓度为：4～6％聚蔗糖400、5～10％木糖醇、2～4％谷氨酸和0.5～2％维生素e。实验证明，该配方条件下，冻干保护剂的冻干效果更好。
7、进一步优选地，所述冻干保护剂包括以下浓度的各成分：5％聚蔗糖400、5％木糖醇、2％谷氨酸和1％维生素e。该条件的冻干保护剂的冻干效果更佳。
8、优选地，所述冻干保护剂在应用时，聚蔗糖400的工作浓度为0.02％，木糖醇的工作浓度为0.02％，谷氨酸的工作浓度为0.008％，维生素e的工作浓度为0.004％。该条件下，试剂的冻干效果更好。即使用时，上述冻干保护剂稀释至上述工作浓度，可达到最好的效果。
9、第二方面，本专利技术还提供上述冻干保护剂在荧光定量pcr试剂冻干中的应用。
10、可选地，所述荧光定量pcr试剂包括qpcr试剂、rt-qpcr试剂。
11、第三方面，本专利技术还提供一种荧光定量pcr检测试剂盒，其包括前述冻干保护剂。
12、可选地，所述荧光定量pcr检测试剂盒包括qpcr检测试剂盒、rt-qpcr检测试剂盒。
13、第四方面，本专利技术还提供一种荧光定量pcr试剂的冻干方法，其包括以下步骤：
14、将前述冻干保护剂与荧光定量pcr试剂进行混合，并将混合液按照冻干程序进行冷冻干燥，得到荧光定量pcr试剂冻干粉。
15、优选地，冻干保护剂添加到荧光定量pcr试剂后，混合液中保证冻干保护剂的浓度为：聚蔗糖400的工作浓度为0.02％，木糖醇的工作浓度为0.02％，谷氨酸的工作浓度为0.008％，维生素e的工作浓度为0.004％。
16、优选地，所述荧光定量pcr试剂的冻干方法中，其冻干程序包括以下步骤：
17、预冻阶段：在-40℃～-50℃的温度条件下预冻3～5h；升华干燥阶段：真空度保持在1～10pa，在-35℃～-45℃的温度条件下保持8～12h；解析干燥阶段：真空度保持在1～10pa，在25℃～35℃的温度条件下保持1～3h。
18、优选地，所述冻干程序步骤为：预冻阶段：温度-45℃预冻4h；升华干燥阶段：真空度保持在1～10pa，温度-40℃保持10h；解析干燥阶段：真空度保持在1～10pa，温度30℃保持2h。
19、第五方面，本专利技术还提供一种用于同时检测结核分枝杆菌、甲型流感病毒的引物探针组合物，其包括：
20、用于检测结核分枝杆菌的引物探针包括：序列如seq id no.1所示的上游引物tb-f，序列如seq id no.2所示的下游引物tb-r，序列如seq id no.3所示的荧光探针tb-p；
21、用于检测甲型流感病毒的引物探针包括：序列如seq id no.4所示的上游引物iva-f，序列如seq id no.5所示的下游引物iva-r，序列如seq id no.6所示的荧光探针iva-p。
22、上述序列分别如下：
23、seq id no.1：针对结核分枝杆菌设计的上游引物，该上游引物的序列为5’-cgccaactacggtgtttacgg-3’；简称tb-f；
24、seq id no.2：针对结核分枝杆菌设计的下游引物，该下游引物的序列为5’-tggtcctgcgggctttgc-3’；简称tb-r；
25、seq id no.3：针对结核分枝杆菌设计的荧光探针，该荧光探针的序列为5’-cgcaaagtgtggctaaccctgaaccgtga-3’；简称tb-p；该荧光探针的5’端标记为报告基团6-fam，3’端标记为猝灭基团bhq1；
26、seq id no.4：针对甲本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种适用于荧光定量PCR试剂的冻干保护剂，其特征在，包括以下成分：聚蔗糖400、木糖醇、谷氨酸和维生素E。
2.根据权利要求1所述的适用于荧光定量PCR试剂的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括以下成分，各成分的质量百分浓度为：4～6％聚蔗糖400、5～10％木糖醇、2～4％谷氨酸和0.5～2％维生素E。
3.根据权利要求2所述的的适用于荧光定量PCR试剂的冻干保护剂，其特征在于，包括以下质量百分浓度的各成分：5％聚蔗糖400、5％木糖醇、2％谷氨酸和1％维生素E。
4.如权利要求1～3中任一项所述的冻干保护剂在荧光定量PCR试剂冻干中的应用。
5.一种荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～3中任一项所述的冻干保护剂。
6.一种荧光定量PCR试剂的冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的荧光定量PCR试剂的冻干方法，其特征在于，所述冻干程序包括以下步骤：
8.一种用于检测结核分枝杆菌、甲型流感病毒的引物探针组合物，其特征在于，包括：
10.根据权利要求9所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括：如权利要求1～3中任一项所述的冻干保护剂；或者，荧光定量检测试剂是采用权利要求1～3中任一项所述的冻干保护剂进行冻干处理得到。
...【技术特征摘要】
1.一种适用于荧光定量pcr试剂的冻干保护剂，其特征在，包括以下成分：聚蔗糖400、木糖醇、谷氨酸和维生素e。
2.根据权利要求1所述的适用于荧光定量pcr试剂的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括以下成分，各成分的质量百分浓度为：4～6％聚蔗糖400、5～10％木糖醇、2～4％谷氨酸和0.5～2％维生素e。
3.根据权利要求2所述的的适用于荧光定量pcr试剂的冻干保护剂，其特征在于，包括以下质量百分浓度的各成分：5％聚蔗糖400、5％木糖醇、2％谷氨酸和1％维生素e。
4.如权利要求1～3中任一项所述的冻干保护剂在荧光定量pcr试剂冻干中的应用。
5.一种荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，其包...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，陈娇，田永帅，刘嘉男，左雪梅，宋金玲，刘万建，
申请(专利权)人：青岛汉唐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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