一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用，属于生物工程领域。本发明专利技术通过复苏培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液，并进行连续多代的传代培养，间隔一定的代数取样并检测，通过检测人工保藏的含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌的遗传稳定性，为研究猪乙脑病毒提供可靠的支撑和保障；将上述检测方法应用到猪乙脑病毒培养中，也可以为猪乙脑病毒的研究和培养提供参考和借鉴，具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用
本专利技术涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用。
技术介绍
流行性乙型脑炎病毒简称乙脑病毒。流行性乙型脑炎的病原体。呈球状，核酸为单链RNA，外层具包膜，包膜表面有血凝素。低温条件下，能自下而上较长时间，在动物、鸡胚及组织培养细胞中均能增殖。幼猪是乙脑病毒的主要传染源和中间宿主，蚊子是乙脑病毒的传播媒介。家畜和家禽在流行季节感染乙脑病毒，一般为隐性感染，但病毒在其体内可增殖，侵入血流，引起短暂的病毒血症，成为乙脑病毒的暂时贮存宿主，经蚊叮咬反复传播，成为人类的传染源。特别是当年生仔猪最为重要，对乙脑病毒易感，构成猪—蚊—猪的传播环节。目前很少有针对猪乙脑病毒人工保藏的稳定性的研究。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，通过本检测方法，可以对猪乙脑病毒的遗传稳定性有较为可靠的认识，为猪乙脑病毒的研究提供可靠的支持。本专利技术的第二目的在于提供上述猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法在猪乙脑病毒培养中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，采用以下技术方案：一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，包括：于液体培养基中培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液；连续传代培养宿主菌菌液；间隔取样传代培养的宿主菌菌液并进行遗传稳定性检测。上述猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法在猪乙脑病毒培养中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过复苏培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液，并进行连续多代的传代培养，间隔一定的代数取样并检测，通过检测人工保藏的含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌的遗传稳定性，为研究猪乙脑病毒提供可靠的支撑和保障；将上述检测方法应用到猪乙脑病毒培养中，也可以为猪乙脑病毒的研究和培养提供参考和借鉴，具有重要的应用价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实验例4提供的第5代大肠杆菌的菌落形态图；图2为本专利技术实验例4提供的第15代大肠杆菌的菌落形态图；图3为本专利技术实验例4提供的第25代大肠杆菌的菌落形态图；图4为本专利技术实验例4提供的第40代大肠杆菌的菌落形态图；图5为本专利技术实验例4提供的PCR电泳结果图；图6为本专利技术实验例4提供的PCR电泳结果图；图7为本专利技术实验例4提供的第5代大肠杆菌生化实验结果图；图8为本专利技术实验例4提供的第15代大肠杆菌生化实验结果图；图9为本专利技术实验例4提供的第25代大肠杆菌生化实验结果图；图10为本专利技术实验例4提供的第40代大肠杆菌生化实验结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。流行性乙脑病毒临床上表现为高烧、意识障碍、抽搐、颅内压升高以及脑膜刺激症。重症可能死于呼吸循环衰竭，部分患者病后遗留失语、强直性痉挛、精神失常等后遗症。猪感染猪乙脑病毒后，严重影响其生长发育；对生猪养殖带来巨大的影响，另外，如果染病的生猪被宰杀后贩卖，对消费者也是一种不安全因素，因此对猪乙脑病毒的检测就是必要的；而猪乙脑病毒的遗传稳定性尤其是人工保藏条件的遗传稳定性也是必要的。下面对本专利技术实施例的一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用进行具体说明。一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，包括：于液体培养基中培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液；连续传代培养宿主菌菌液；间隔取样传代培养的宿主菌菌液并进行遗传稳定性检测。病毒通常需要宿主能生长繁殖，因此将感染了猪乙脑病毒的细胞进行培养和保存，实现间接的保存猪乙脑病毒；含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌在保藏过程中和传代中，有可能造成猪乙脑病毒质粒从宿主细胞中丢失，造成猪乙脑病毒质粒的保藏或传代的失败，因此对已经进行多代传代的含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌进行鉴定，可以了解含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌的遗传稳定性。猪乙脑病毒质粒是将cccagtacgataccaaacttcagcagtgcagagagagcaccaagggaatgaaatagtggatgtgatgtgccatgccactctgacccacagattgatgtcaccgaacagagtgcccaactataacctatttgtcatggatgaagctcatttcaccgacccagccagtatagccgcacgaggatacatcgctaccaaggtggaattaggagaggcagcagccatctttatgacagcgaccccgcctggaaccacggatccttttcctgactcaaatgccccaatccatgatctacaagatgagataccagacagggcatggagcagtggatacgaatggatcacagaatatgcgggtaaaaccgtgtggtttgtggcgagcgtaaaaatggggaatgaaattgcaatgtgcctccaaagagcgggaaaaaaggtcatccaactcaaccgcaagtcctatgacacagaatacccaaaatg连接到pUC-57为载体上得到。鉴定引物的上游序列SEQNO.1为：5’-AGAGAGAGCACCAAGGGAATG-3’；鉴定引物的下游序列SEQNO.2为：5’-CTTGCGGTTGAGTTGGATGAC-3’；检测引物扩增的片段长度为422bp。进一步地，宿主菌菌液的接种量为液体培养基的体积的1％-10％。宿主菌与液体培养基保持一个合理的接种比例，可以保证菌液能较快的复苏和进入对数期，可以较大的节约实验的时间，加快实验进程。进一步地，宿主菌菌液为甘油菌液。通常甘油菌为低温保藏，由于甘油有防冻的效果，通过添加甘油，可以有效的保护菌株在低温条件不被破坏；而且由于甘油具有保湿的效果，可以较好的保证菌液的水分，保证菌种的活性。进一步地，甘油菌液的制备包括：将含猪乙脑病毒的病毒质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过引物检测鉴定，得到阳性的重组大肠杆菌；培养重组大肠杆菌，并添加甘油制成甘油菌种保藏。进一步地，大肠杆菌感受态细胞为TOP10细胞、DH5α细胞和BL21(DE3)细胞中的一种。由于大肠杆菌的生长迅速，将大肠杆菌作为宿主菌，通过简单的复苏培养和传代培养，可以较快获得大量的菌液，即可以获得大量的猪乙脑病毒的病毒质粒。进一步地，含猪乙脑病毒的病毒质粒与大肠杆菌感受态细胞的体积比为1-4:100。通过控制病毒质粒与大肠杆菌感受态细胞的比例，可以提高质粒的转化效率。进一步地，含猪乙脑病毒的病毒质粒的浓度为0.1-10ng/μL。进一步地，转化的方法为：混合含猪乙脑病毒的病毒质粒和大肠杆菌感受态细胞，冰上放置25-37min；热激60-100s，冰上放置2-3min。进一步地，检测鉴定通过PCR反应实现，PCR反应的退火温度为52-58℃。上述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，包括：于液体培养基中培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液；连续传代培养所述宿主菌菌液；间隔取样所述传代培养的所述宿主菌菌液并进行遗传稳定性检测。

【技术特征摘要】
1.一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，包括：于液体培养基中培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液；连续传代培养所述宿主菌菌液；间隔取样所述传代培养的所述宿主菌菌液并进行遗传稳定性检测。2.根据权利要求1所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述宿主菌菌液的接种量为所述液体培养基的体积的1％-10％。3.根据权利要求1所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述宿主菌菌液为甘油菌液。4.根据权利要求3所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述甘油菌液的制备包括：将含猪乙脑病毒的病毒质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过鉴定引物检测鉴定，得到阳性的重组大肠杆菌；培养所述重组大肠杆菌，并添加甘油制成甘油菌种保藏。5.根据权利要求4所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为TOP10细...

【专利技术属性】
技术研发人员：余美伦，秦香芹，孟庆雪，李影，韩伟丽，孙均，赵丽，何佳，王春东，苑玉凤，王宁，闫增福，
申请(专利权)人：哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23