用鳞翅目粘虫卵巢细胞制备流行性乙脑疫苗的方法及疫苗技术

本发明专利技术涉及一种制备流行性乙脑疫苗的方法，它包括在培养基中静止或悬浮培养鳞翅目粘虫（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）的卵巢细胞，将该细胞感染乙脑病毒继续培养得培养悬液，可部分补充培养液连续培养，得到的病毒灭活或不灭活制备疫苗。 本方法中可使用无血清培养基。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法及由此方法制得的疫苗。尤其涉及一种利用鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞制备流行性乙型脑炎疫苗的方法及由此方法制得的疫苗。流行性脑炎病毒又称日本乙型脑炎病毒(JEV)，可引起流行性乙型脑炎。自1935年日本学者从病死者脑组织分离并确定乙脑病毒以来，各国学者一直在致力于JEV疫苗的研究制备工作，先后经历了用鼠脑、鸡胚、地鼠肾等生产基质制备灭活疫苗、减毒活疫苗等阶段。目前我国使用的是用原代地鼠肾细胞制备的灭活疫苗和减毒活疫苗，日本、美国、台湾等地使用的是鼠脑提纯疫苗。此外，重组基因工程疫苗正处于研究之中，但至今尚无重大突破。现有技术中生产JEV疫苗主要存在的问题是，疫苗生产方法中因使用原代细胞或动物组织培养使得动物的饲养、繁殖、无菌条件的控制及解剖均存在着诸多不便，从而限制了生产规模。因此使用一种既对乙脑病毒敏感又可用于悬浮培养的传代细胞基质是解决问题的途径之一。vero细胞被证明可作为疫苗生产的基质(WHO Tech.Rep.Ser.，1987，71)，同时也是乙脑病毒的敏感细胞，用其制备乙脑疫苗的研究工作也正在进行，但该细胞为锚着依赖性细胞，培养时需借助于微载体，培养条件复杂；由于培养液中含有血清，须经纯化彻底去除以避免临床中出现副反应；此外，所有来源于啮齿类动物的传代细胞都存在致肿瘤性的危险，而vero细胞属哺乳类动物，较高代次的vero细胞已被证明存在致肿瘤性。近年来，一种属鳞翅目粘虫(Spodopterafrugiperda)的卵巢细胞，例如Sf9细胞已被广泛应用于重组杆状病毒的表达系统上表达各种外源蛋白，Sf9细胞由IPL41-SF21AE细胞系中克隆筛选而来(Vaughn，J.L.et al，In Vitro 13213-217)，为非锚着依赖性细胞，其培养条件为28℃无需二氧化碳。因此，本专利技术的目的在于提供一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，该方法利用鳞翅目粘虫(Spodopterafrugiperda)的卵巢细胞工业化大规模生产流行性乙型脑炎疫苗，培养过程中可不必借助于微载体等附着物，培养条件简单，因而降低生产成本，简化工艺，而且用WHO规程规定的细胞致肿瘤检测方法证明Sf9细胞无致肿瘤原性。本专利技术的另一目的在于提供一种利用本专利技术的方法制成的流行性乙型脑炎疫苗。为克服现有技术的不足，完成上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案本专利技术涉及一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其特征是包括下述步骤在pH为6.1-7.6的培养液中悬浮或静止培养细胞基质鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞，使细胞浓度达到105-107/ml；以感染剂量(M.O.I.)为0.01-1.0将流行性乙型脑炎病毒接种到具有上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养3-5天后得细胞培养悬液；低速离心部分细胞培养悬液，取上清过滤收获病毒；可用新鲜培养液补足剩余的细胞培养悬液继续传代培养，3-5天后离心收获病毒；超速离心去除残余小牛血清；用福尔马林灭活收获的病毒制备灭活疫苗或不经灭活病毒制备减毒活疫苗。按照本专利技术方法，感染病毒后的细胞基质培养液为有血清培养液。本专利技术涉及一种利用上述本专利技术方法制得的流行性乙型脑炎疫苗。另外，本专利技术还涉及一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其特征是包括下述步骤在pH为6.1-7.6的培养液中悬浮或静止培养细胞基质鳞翅目粘虫(Sodoptera frugiperda)的卵巢细胞，使细胞浓度达到105-107/ml；以感染剂量(M.O.I.)为0.01-1.0将流行性乙型脑炎病毒接种到具有上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养3-5天后得细胞悬液；将上述感染病毒后的细胞悬液在无血清培养液中经逐步适应传代至其培养液中的血清含量低于0.1％；低速离心部分适应后的无血清培养细胞悬液，取上清液过滤收获病毒；用新鲜无血清培养液补足剩余的细胞培养悬液继续传代培养，3-5天后离心收获病毒；用福尔马林灭活收获的病毒制备灭活疫苗或不经灭活病毒制备减毒活疫苗。本专利技术还涉及一种利用上述本专利技术方法制得的流行性乙型脑炎疫苗。本专利技术与现有技术相比其优点在于首先，本专利技术细胞基质具有传代细胞的优点，即可以事先被检定不带任何可查出的细菌、病毒、致癌物质等外源致病因子。其次，本专利技术所采用的细胞基质为非锚着依赖性细胞，其可以不需要载体大量悬浮培养，且培养条件要求较低，这就简化了锚着依赖性细胞(如vero细胞)深层培养所必不可少的微载体带来的诸多不便。再者，目前认为哺乳动物传代细胞都存在致肿瘤性的危险，传代次数越高其危险性越大，而对昆虫细胞，一般认为人源性远，致肿瘤的危险性小，且用WHO规程规定的细胞致癌检测方法证明72代Sf9细胞无致肿瘤原性。另外，利用乙脑病毒对Sf9细胞持续性感染的特性，一次种毒后细胞可连续产毒、连续收获病毒，而且感染乙脑病毒后的细胞可在液氮中冷冻保存。本专利技术的最重要的优点在于，持续感染JEV的本专利技术的细胞基质在无血清培养液中可利用发酵罐大规模繁殖病毒，因此既解决了现有技术中纯化病毒时难以去除残余牛血清的问题，又避免了临床接种带来的副反应。附图的简要说明附图说明图1、图2及图3分别示出了实验例1中用P3、SA14、SA14-14-2分别感染Sf9细胞10-12周内培养物上清液和细胞溶解物的病毒滴度和传代时间之间的曲线。为了进一步理解本专利技术的技术方案，以下详细描述之。本专利技术实质上涉及一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其特征是包括下述步骤1)在pH为6.1-7.6的培养液中静止或悬浮培养细胞基质鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞，使细胞浓度达到105-107/ml；其中，所述的鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞可以是例如Sf9细胞(ATCC CRL1711)，它由IPL41-SF21AE细胞系中克隆筛选而来，为非锚着依赖性细胞，可以不需载体大量悬浮培养。本专利技术采用的Sf9细胞仅为所述的鳞翅目粘虫的卵巢细胞的一株，本文中仅作为实施例而用之，并非有限定本专利技术之意。另外，本专利技术采用的培养液可以为市售的有血清培养液，如GIBCO的IPL-41。培养温度为本领域技术人员所熟知，通常为28℃。2)以感染剂量(M.O.I)为0.01-1.0将流行性乙型脑炎病毒接种到具有上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养3-5天后得细胞培养悬液；按照本专利技术，所述的JEV病毒可以是野毒株，例如P3株和SA14株；也可以是减毒株，例如SA14-14-2株。其中野毒株感染后3-5天，细胞出现以一定数量细胞增大3-5倍为特征的细胞病变(CPE)，减毒株感染细胞后无此病变，但两种病毒均可造成Sf9细胞的持续感染。3)低速离心部分上述细胞培养悬液，取上清液过滤收获病毒；按照本专利技术，此步骤中对用于离心的培养悬液量无特殊的限制，只要剩余的细胞量足以在经补充新鲜培养液培养3-5天后细胞培养悬液又能达到可以收获的病毒滴度即可，例如实施例1中用于离心的培养悬液量为50-75％。4)可用新鲜培养液补足剩余的培养悬液继续传代培养，3-5天后离心收获病毒；此步骤中补加的新鲜培养液量与步骤3)中用于离心的培养悬本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其特征是包括下述步骤： 在ｐＨ为６．１－７．６的培养液中静止或悬浮培养细胞基质鳞翅自粘虫（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）的卵巢细胞，使细胞浓度达到１０↑［５］－１０↑［７］／ｍｌ； 以感染剂量（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）为０．０１－１．０将流行性乙型脑炎病毒接种到具有上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养３－５天后得细胞培养悬液； 低速离心部分细胞培养悬液，取上清液过滤收获病毒； 可用新鲜培养液补足剩余的细胞培养悬液继续传代培养，３－－５天后离心收获病毒； 超速离心去除残余小牛血清； 用福尔马林灭活收获的病毒制备灭活疫苗或不经灭活病毒制备减毒活疫苗。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏飞，傅大卫，
申请(专利权)人：云南绿舟药业有限公司，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]