一种化合物皮肤致敏体外评估细胞模型及其构建方法技术

本发明专利技术公开一种化合物皮肤致敏体外评估细胞模型及其构建方法。该细胞模型的构建方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9设计并构建sgRNA表达载体；设计并构建能将连接自裂解肽序列的报告基因定点敲入HMOX1基因的表达框内的同源重组载体；将同源重组载体，与hCas9质粒、sgRNA表达载体共转染细胞，进行单克隆化扩大培养，即得细胞模型。本发明专利技术通过CRISPR/CAS9结合细胞单克隆技术，获得HMOX1基因终止密码子前敲入荧光素酶基因的HaCaT细胞模型。该细胞模型实现荧光素酶基因与HMOX1基因的同步表达，从而有效分辨致敏化合物和非致敏化合物，为化合物致敏性研究提供更特异，更灵敏的细胞模型。

【技术实现步骤摘要】
一种化合物皮肤致敏体外评估细胞模型及其构建方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种化合物皮肤致敏体外评估细胞模型及其构建方法，特别涉及一种CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型及其方法。
技术介绍
皮肤致敏是一种由皮肤接触诱发物导致的迟发性超敏反应，致敏化合物与内源蛋白结合形成半抗原，引起皮肤树突细胞激活及角质细胞系列反应，进而激活T细胞，导致淋巴结增生及机体皮肤炎症反应，这一过程也称皮肤致敏有害结局路径AOP。皮肤致敏的动物实验主要有豚鼠皮肤实验和小鼠局部淋巴结试验(locallymphnodeassay，LLNA)，其中示踪剂改良版的LLNA:BrdUELISA成为应用最为广泛的全球标准方法，也是目前我国皮肤致敏评价的主要方法。但是随着国际社会对实验动物福利伦理及3R原则的不断推行，且动物皮肤反应与人亦存在差异，替代动物的体外皮肤致敏评价方法研发迫在眉睫。由于皮肤致敏有害结局路径AOP已经比较清晰，因此基于AOP的关键步骤，开发模拟体内致敏过程的系统模型，是目前国内外体外替代方法研发的基本策略。其中模拟致敏过程细胞反应的关键事件，建立荧光素酶报告细胞模型是致敏评估准确高效性及实现高通量的重要手段。目前国内外较为认可的报告细胞模型多集中在角质细胞及树突状细胞激活路径两个水平，包括针对Keap1-Nrf2-ARE通路的KeratinoSensTM、LuSens、ARE-blaHepG2、HMOX1-Luciferase等模型及评估IL-8表达的THP-G8细胞，其中KeratinoSensTM已成为OECD指导原则，LuSens和THP-G8也已得到欧洲ECVAM认可。以上报告细胞模型均是通过将靶基因调控元件与荧光素酶基因组合，通过荧光素酶表达间接反应靶基因表达。KeratinoSensTM细胞的调控元件为SV40与人AKR1C2基因的ARE元件组合，同样LuSens细胞的ARE调控元件来自大鼠NQO1基因，两个细胞模型的评估准确率分别可高达75～96％和71～85％。类似方法跟踪IL-8细胞表达的THP-G8细胞准确率高达82％。部分细胞模型的检测准确率甚至高于小鼠局部淋巴结实验LLNA，表明基于AOP的报告细胞是LLNA的体外有效替代方法。但是这些报告细胞模型仅仅间接反应靶基因表达，而非真正意义的实时报告基因表达。模型实质为调控元件-荧光素酶随机插入的转基因细胞，虽然细胞在一定程度上可通过荧光素酶的表达间接评估靶基因的表达，但是并非真正意义的同步追踪内源基因表达的报告细胞，导致模型仅可评估化合物是否致敏，难以定量评估致敏强弱。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的构建方法。本专利技术的另一目的在于提供上述CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型。本专利技术的再一目的在于提供上述CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的构建方法，包括如下步骤：(1)利用CRISPR/Cas9设计对HMOX1基因靶点特异性的sgRNA，并构建sgRNA表达载体；(2)设计并构建能将连接自裂解肽序列的报告基因定点敲入HMOX1基因的表达框内的同源重组载体；(3)将构建的同源重组载体，与hCas9质粒、sgRNA表达载体共转染哺乳动物的角质细胞、树突状细胞或单核细胞，进行单克隆化扩大培养，即得HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型。优选的，步骤(1)中所述的sgRNA的序列为SEQIDNO：1或SEQIDNO：3所示。优选的，步骤(1)中，以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体；优选的，步骤(2)中所述的报告基因为荧光素酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)或二氢叶酸还原酶基因等；优选的，步骤(2)中所述的自裂解肽为T2A肽、E2A肽、F2A肽或P2A肽等。优选的，步骤(2)中所述的定点位于HMOX1基因(NG_023030)的17529位与17530位碱基之间，但不限于该位置。所述的HMOX1基因均指NCBI登录号为NG_023030，含有非编码区的HMOX1基因。优选的，步骤(2)中所述的同源重组载体的序列如SEQIDNO：4所示。优选的，步骤(3)中所述的哺乳动物的角质细胞为HaCaT细胞，但不限于此。优选的，步骤(3)中所述的哺乳动物的树突状细胞为CD34来源的树突状细胞，但不限于此。优选的，步骤(3)中所述的哺乳动物的单核细胞为THP-1细胞，但不限于此。一种CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型，通过上述构建方法构建得到。所述的细胞模型在分辨化合物致敏性中的应用。本专利技术的机理是：基于文献报道的皮肤致敏细胞转录组数据及获国际认可几种皮肤致敏报告细胞模型，针对AOP路径的角质细胞水平反应选择HMOX1基因作为靶基因。随着近年来CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展，基因组定点编辑的效率显著提高，因此借助该技术可将荧光素酶报告基因定点插入到内源靶基因表达框内，荧光素酶基因伴随着靶基因表达而表达，可达到真正实时报告内源靶基因的表达，从而更加准确科学的评估皮肤致敏反应。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术通过CRISPR/CAS9结合细胞单克隆技术，获得HMOX1基因终止密码子前敲入荧光素酶基因的HaCaT细胞模型。该细胞模型实现荧光素酶基因与HMOX1基因的同步表达，从而有效分辨致敏化合物和非致敏化合物，为化合物致敏性研究提供更特异，更灵敏的细胞模型。附图说明图1是sgRNA靶点切割的T7E1酶切鉴定结果图。图2是HaCaT细胞单克隆(6号)的示意图。图3是HaCaT细胞单克隆(8号)的示意图。图4是HaCaT细胞单克隆(10号)的示意图。图5是HaCaT细胞单克隆(38号)的示意图。图6是HaCaT细胞单克隆(43号)的示意图。图7是6、10号单克隆荧光素酶基因敲入PCR鉴定结果图。图8是8号单克隆荧光素酶基因敲入PCR鉴定结果图。图9是38号单克隆荧光素酶基因敲入PCR鉴定结果图。图10是43号单克隆荧光素酶基因敲入PCR鉴定结果图。图11是38号单克隆荧光素酶基因敲入测序鉴定结果图。图12是38号单克隆检测肉桂醇、2-巯基苯并噻唑、磺胺致敏性的结果图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。实施例1本专利技术实施例中，CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入荧光素酶基因的HaCaT细胞模型的构建方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：1.针对HMOX1基因设计靶点特异性的sgRNA，构建其表达载体，并进行靶点切割有效性检测。针对HMOX1(NCBI登录号：NG_023030HMOX1)的基因终止密码子附近，设计特异性sgRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)利用CRISPR/Cas9设计对HMOX1基因靶点特异性的sgRNA，并构建sgRNA表达载体；(2)设计并构建能将连接自裂解肽序列的报告基因定点敲入HMOX1基因的表达框内的同源重组载体；(3)将构建的同源重组载体，与hCas9质粒、sgRNA表达载体共转染哺乳动物的角质细胞、树突状细胞或单核细胞，进行单克隆化扩大培养，即得HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型。

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)利用CRISPR/Cas9设计对HMOX1基因靶点特异性的sgRNA，并构建sgRNA表达载体；(2)设计并构建能将连接自裂解肽序列的报告基因定点敲入HMOX1基因的表达框内的同源重组载体；(3)将构建的同源重组载体，与hCas9质粒、sgRNA表达载体共转染哺乳动物的角质细胞、树突状细胞或单核细胞，进行单克隆化扩大培养，即得HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型。2.根据权利要求1所述的CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的构建方法，其特征在于：步骤(1)中所述的sgRNA的序列为SEQIDNO：1或SEQIDNO：3所示。3.根据权利要求1所述的CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体。4.根据权利要求1所述的CRISPR/CAS9介导HMOX1基因靶向性敲入报告基因的细胞模型的构建方法，其特征在于：步骤(2)中所述的报告基因为荧光素酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β-半乳糖苷酶基因或二氢叶...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄黎珍，钟国瑞，李浩健，谢水林，庞士慧，白静，何昌生，都心怡，张琪霄，王海杰，杜红丽，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44