一种高效的外泌体分离方法技术

本发明专利技术提供一种高效的外泌体分离方法，所述分离方法至少包括以下步骤：（1）向目标细胞中导入带有标签的CD63，培养；（2）离心后取上清液；（3）向上清液中加入磁性体，所述磁性体上含有能够与CD63上的标签特异性结合的标记物，孵育；（4）将上清液置于磁场中；（5）去除上清液后加入缓冲液，加入分选柱，利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体，并收集。采用本发明专利技术所述的收集方法，收集效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种高效的外泌体分离方法
本专利技术涉及一种高效的外泌体分离方法，属于生物

技术介绍
外泌体(exosome)是由细胞内多泡体(multivesicularbody，MVB)与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30～120nm的膜性囊泡。最早由Johnstone等研究者在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程时发现。又经过多年研究，科学家发现除了网织红细胞以外，T细胞、B细胞、血小板、树突细胞、肥大细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等其他非血源性细胞都会分泌外泌体，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。外泌体中包含多种RNA分子，包括mRNA、miRNA等。但也有少数报道指出，某些特殊来源的外泌体也会包含DNA分子，例如，有研究者发现恶性胶质瘤及星形细胞瘤细胞所释放的外泌体中可能含有线粒体DNA。自2007年首次在外泌体中发现mRNA和miRNA，研究者已在人类及小鼠外泌体中发现了数千个不同mRNA，而且有些转录本只存在于外泌体中，在胞内却无法检测到。这表明，RNA进入外泌体的过程会受到某些特殊的分选机制控制。目前，外泌体RNA分子收录最全的数据库共收录2375个外泌体mRNA和764个miRNA，但是这也仅仅是能够检测到的所有外泌体RNA的一部分，仍旧有大量外泌体RNA的功能未知。最常见的外泌体蛋白组成包括膜转运和融合相关蛋白(RabGTPases、Annexins、Flotillin等)、多囊泡胞内体产生相关蛋白(Alix、TSG101等)、热休克蛋白家族(HSP70，HSP90)、整合素和四跨膜蛋白超家族(CD63、CD9、CD81、CD82等)，这些成分反映了其生物起源。蛋白质，如CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix和HSP70常见于大多数外泌体中。目前，针对外泌体相关的功能学研究越来越多，但是从细胞中分离得到的外泌体时，回收率很低，需要收集大量细胞培养上清，以满足实验需求。另外，目前公认超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。但过程比较费时，且重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。此外，在研究特定细胞分泌的外泌体对其他细胞的功能研究时，通常在感染一段时间后，采用Westernblot来验证，不能实时监测。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种外泌体分离方法，用于解决现有技术的不足。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种高效的外泌体分离方法，所述分离方法至少包括以下步骤：(1)向目标细胞中导入带有标签的CD63，使用细胞培养基进行培养；所述标签是指可以起到标记蛋白质的物质，可以采用现有技术中的作为标签的物质以及方法。优选地，所述标签选自Flag、His6、GST、MBP、His-MBP、HA中的任意一种或几种。优选地，所述CD63通过载体携带导入目标细胞；所述载体是指pcDNA3.1。优选地，向目标细胞中导入带有标签的CD63后培养12～36h后筛选出含有CD63的阳性克隆细胞，再继续培养阳性克隆细胞。所述筛选的方法可以是使用G418抗生素筛选细胞。优选地，所述步骤(1)中CD63通过pCD63-3*Flag导入目标细胞，所述pCD63-3*Flag通过载体、CD63片段和3flag片段按1:3:3的摩尔比加入到HB-infusion无缝克隆试剂获得；优选地，步骤(1)中所述细胞培养基组分如下：优选地，所述氨基酸选自L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的任意一种或几种。(2)离心后取上清液；离心后取出细胞碎片以及凋亡小体；优选地，离心前清洗细胞；所述清洗可以采用无血清的a-MEM。优选地，所述离心的条件为1500～4500转/分，时间为15～45分钟；优选地，向离心后的上清液中加入缓冲液。缓冲液可以采用现有技术中常用的，例如磷酸盐缓冲液(PBS)。(3)向上清液中加入磁性体，所述磁性体上含有能够与CD63上的标签特异性结合的标记物，孵育；所述磁性小体是指具有磁性的物质，例如可以采用flag抗体包被的Dynabeads：包被有flag抗体的包被的beads，孔间平均变异(CV<3％)不高于10％。购自上海钰博生物科技有限公司。优选地，所述孵育的温度为2～5℃，时间15～20分钟。(4)将上清液置于磁场中；优选地，所述将上清液置于磁场中的同时离心，离心的条件为1500～4500r/min，时间5～20min。(5)去除上清液后加入缓冲液，加入分选柱，利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体。将上清液加入分选柱后，先流出的没有被标记外泌体，然后采用缓冲液洗脱分选柱，流出的才是被标记的外泌体。如上所述，本专利技术的外泌体的分离方法，具有以下有益效果：在传统超速离心收集外泌体的基础上进行离心条件优化后，获得的外泌体产量更高，感染目的细胞时效果更好，离心时间也较传统的方法减少很多，由8小时降低到2小时。附图说明图1显示为本专利技术实施例1的实验结果示意图。图2显示为本专利技术实施例2的实验结果示意图。图3显示为本专利技术实施例3的实验结果示意图。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围；在本专利技术说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。除非另外说明，本专利技术中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效的外泌体分离方法，其特征在于，所述分离方法至少包括以下步骤：(1)通过载体向目标细胞中导入带有标签的CD63，导入成功后培养12～36h，然后筛选出含有CD63的阳性克隆细胞，再继续培养阳性克隆细胞；(2)离心前清洗细胞；对阳性克隆细胞进行离心，所述离心的条件为1000g离心5min，随后4℃12000g；离心30min离心后取上清液，并向离心后的上清液中加入缓冲液；(3)向上清液中加入磁性体，所述磁性体上含有能够与CD63上的标签特异性结合的标记物，孵育；(4)将上清液置于磁场中；(5)去除上清液后加入缓冲液，加入分选柱，利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体，并收集。

【技术特征摘要】
1.一种高效的外泌体分离方法，其特征在于，所述分离方法至少包括以下步骤：(1)通过载体向目标细胞中导入带有标签的CD63，导入成功后培养12～36h，然后筛选出含有CD63的阳性克隆细胞，再继续培养阳性克隆细胞；(2)离心前清洗细胞；对阳性克隆细胞进行离心，所述离心的条件为1000g离心5min，随后4℃12000g；离心30min离心后取上清液，并向离心后的上清液中加入缓冲液；(3)向上清液中加入磁性体，所述磁性体上含有能够与CD63上的标签特异性结合的标记物，孵育；(4)将上清液置于磁场中；(5)去除上清液后加入缓冲液，加入分选柱，利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体，并收集。2.根据权利要求1所述的外泌体分离方法，其特征在于：所述标签选自Flag、His6、GST、MBP、His-MBP、HA中的任意一种或几种。3.根据权利要求1所述的外泌体分离方法，其特征在于：所述步骤(3)中孵育的温度...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈意雄，
申请(专利权)人：上海恒圆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31