本发明专利技术公开了一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法，所述方法为：将肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液离心，取上清液与偶联复合物混合，在4℃、100‑300rpm水平振荡条件下孵育3‑16h，去除液体，获得孵育后的偶联复合物并用PBS缓冲液清洗，获得吸附微囊泡的偶联微球；本发明专利技术采用的方法提取的总微囊泡，保留了全部微囊泡的结构和成分，产量高。并且可以进行二次分选，对特定的微囊泡进行分析，提高了提取效率和研究价值。总共的提取时间最少只要4小时，就可以完成微囊泡的提纯，最少5小时可以完成外泌体的提纯。而且提取的纯度更高，实验表明，提取的微囊泡占总提取蛋白的90％以上，而有机沉淀的比例不足20％。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种微囊泡的分离，具体涉及到从细胞上清中分离肿瘤细胞来源微囊泡及其外泌体的方法。(二)
技术介绍
微囊泡(microvesicles，MVs)是从细胞膜上脱落或者释放的一种膜性结构，是具有双分子层的膜性小囊泡。MVs含有脂类、蛋白质、mRNA、microRNA(miRNA)及DNA片段等，这些物质来源于母细胞膜或者细胞器。不仅存在于体外培养的细胞中而且存在于体液中。目前研究发现，其起到在细胞、组织、器官间的传递信息作用，并且能够通过其表面或者内含的生物分子而达到对靶细胞、组织、器官的调控作用。其不仅在多种疾病的发生和发展中发挥重要作用，而且还与肿瘤的侵袭、转移、定植都有着密切的关系。因此，分析微囊泡携带的成分对疾病和肿瘤的研究意义重大，这其中最重要的环节是如何高效获取高纯度的微囊泡。目前，微囊泡的提取主要采用超高速梯度离心法、密度梯度超速离心法、超速离心-免疫磁珠亲和法、有机沉淀法等。这些方法各有优缺点：超高速离心法采用超高速离心机价格昂贵，通常采用100,000xg离心60-120分钟，对耗材的要求高、免疫磁珠亲和法可以对提取的微囊泡进行特异性标记的纯化，但是由于目前对于不同来源的微囊泡的标记蛋白还不明确，所以获得的微囊泡产量远低于超速离心的产量，并往往需要多种标记的免疫磁珠进行提取，提高了试剂成本，有机沉淀剂提取的微囊泡纯度相对较低，并且可能对微囊泡本身以及后续分析都产生影响。所以，开发一种高效、简易、价廉的微囊泡提取方法，将对微囊泡在科学研究和临床检测中的推广发挥重要作用。微囊泡虽然能够对疾病和肿瘤的发生和发展起到监测作用，且在细胞上清液和体液中稳定存在，但是由于其体积小、含量低，需要大量细胞上清液，因而采用目前的方法提取成本高。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种从细胞上清中分离肿瘤细胞来源微囊泡及其外泌体的方法，能够从细胞培养上清中获得高纯度、高产量的微囊泡，且能直接用于后续的流式技术检测、qPCR检测、免疫印迹检测的微囊泡。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，所述方法为：将肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液离心，取上清液与偶联复合物混合，在4℃、100-300rpm水平振荡条件下孵育3-16h，去除液体，获得孵育后的偶联复合物并用PBS缓冲液清洗，获得吸附微囊泡的偶联微球；所述偶联复合物是由偶联物与载体偶联制备而成，所述偶联物为亲脂性羰花青染料，更优选所述偶联物为亲脂性羰花青染料DiI、亲脂性羰花青染料DiO、亲脂性羰花青染料DiD或亲脂性羰花青染料CM-DiI，所述载体为四氧化三铁磁微球、乳胶微球、聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、琼脂糖颗粒、葡聚糖颗粒或胶体金颗粒。优选DiO偶联四氧化三铁磁微球，也可以是DiO偶联琼脂糖、DiO偶联葡聚糖、DiO偶联乳胶颗粒、DiO偶联胶体金颗粒等，最优选偶联复合物为DiO偶联四氧化三铁磁微球。本专利技术采用的偶联载体和亲和小分子对亲和环境的容忍度很高，可以不用调节提取溶液的pH，也可以不用浓缩上清液体积，简便了操作方法。所述DiI(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanineperchlorate)分子式为C59H97ClN2O4，分子量为933.88，CASnumber为41085-99-8；DiO(3,3′-dioctadecyloxacarbocyanineperchlorate)分子式为C53H85ClN2O6，分子量为881.72，CASnumber为34215-57-1；DiD(1,1”-dioctadecyl-3,3,3”,3”-tetramethylindodicarbocyanine-4-chlorobenzenesulfonatesalt)，分子式为C67H103ClN2O3S，分子量为1052.1；CM-DiI(3H-Indolium,5-[[[4-(chloromethyl)benzoyl]amino]methyl]-2-[3-(1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-octadecyl-2H-indol-2-ylidene)-1-propenyl]-3,3-dimethyl-1-octadecyl-chloride)，分子式为C68H105Cl2N3O，分子量为1051.5，CASnumber为180854-97-1。进一步，所述肿瘤细胞为人胃腺癌细胞AGS、人胃腺癌细胞BGC-823、人胃癌细胞(未分化)HGC-27、人胃癌细胞MGC80-3或人胃癌细胞(低分化)MKN-45。进一步，所述培养液重复离心，取最后一次离心上清液与偶联复合物混合；所述最后一次离心的上清液体积用量以偶联复合物质量计为1000～2000ml/g。进一步，所述偶联复合物由DiO与四氧化三铁磁微球偶联制成，所述四氧化三铁磁微球直径50-100nm，1mg磁微球最大微囊泡结合量范围为20-50μg。所述偶联复合物中偶联物负载量为3-4×10-6～3-4×10-5mol/mg，即1mg磁微球可以偶联亲脂性羰花青染料DiO3-4×10-5mol。进一步，所述肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液200×g离心10分钟，获得上清液a，然后将上清液a再2000×g离心15-40分钟，取上清液b与偶联复合物混合。进一步，本专利技术为了提更高效率，在培养液离心过程增加超滤，可以将上清液浓缩至2ml，方便后续的提取过程，具体为：所述上清液b用100KDa超滤管在5000rpm离心15分钟，弃滤液，取截留液与偶联复合物混合。进一步，所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法按如下步骤进行：(1)将肿瘤细胞接种于细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到上清液a；(2)将上清液a加入第二离心管中，在2000×g离心15-40分钟，获得上清液b；(3)将上清液b加入100KDa超滤管中，5000rpm离心15分钟，弃滤液，超滤管中剩余液体(即截留液)收集于第三离心管中，加入偶联复合物，置于4℃、100-300rpm水平振荡下孵育3-16小时，移除液体(优选将离心管置于磁力架上，吸附2分钟，或者直至偶联复合物完全吸附至离心管靠磁力架一侧或者1000×g离心1分钟)，获得孵育后的偶联复合物；所述偶联复合物由亲脂性羰花青染料DiO与四氧化三铁磁微球偶联制成；(4)向步骤(3)孵育后的偶联复合物中加入1×PBS充分重悬，移除液体(优选将离心管置于磁力架上，吸附2分钟直至磁微球完全吸附至离心管靠磁力架一侧或者1000×g离心1分钟)，并用1×PBS充分清洗，去除洗液，获得微囊泡磁微球复合物。本专利技术还提供一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡外泌体(50-150nm)的方法，所述方法为：(1)将肿瘤细胞接种于细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到上清液A；(2)将上清液A加入第二离心管中，在2000×g离心15-40分钟，获得上清液B；(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述方法为：将肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液离心，取上清液与偶联复合物混合，在4℃、100‑300rpm水平振荡条件下孵育3‑16h，去除液体，获得孵育后的偶联复合物并用PBS缓冲液清洗，获得吸附微囊泡的偶联微球；所述偶联复合物是由偶联物与载体偶联制备而成，所述偶联物为亲脂性羰花青染料，所述载体为四氧化三铁磁微球、乳胶微球、聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、琼脂糖颗粒、葡聚糖颗粒或胶体金颗粒。
【技术特征摘要】
1.一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述方法为：将肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液离心，取上清液与偶联复合物混合，在4℃、100-300rpm水平振荡条件下孵育3-16h，去除液体，获得孵育后的偶联复合物并用PBS缓冲液清洗，获得吸附微囊泡的偶联微球；所述偶联复合物是由偶联物与载体偶联制备而成，所述偶联物为亲脂性羰花青染料，所述载体为四氧化三铁磁微球、乳胶微球、聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、琼脂糖颗粒、葡聚糖颗粒或胶体金颗粒。2.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述肿瘤细胞为人胃腺癌细胞AGS、人胃腺癌细胞BGC-823、人胃癌细胞、HGC-27、人胃癌细胞MGC80-3或人胃癌细胞MKN-45。3.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述培养液重复离心，取最后一次离心上清液与偶联复合物混合；所述最后一次离心的上清液体积用量以偶联复合物质量计为1000～2000ml/g。4.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述偶联物为亲脂性羰花青染料DiI、亲脂性羰花青染料DiO、亲脂性羰花青染料DiD或亲脂性羰花青染料CM-DiI。5.如权利要求4所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述偶联复合物由亲脂性羰花青染料DiO与四氧化三铁磁微球偶联制成。6.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液200×g离心10分钟，获得上清液a，然后将上清液a再2000×g离心15-40分钟，取上清液b与偶联复合物混合。7.如权利要求6所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述上清液b用100KDa超滤管在5000rpm离心15分钟，弃滤液，取截留液与偶联复合物混合。8.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：程向东，吕航，徐志远，
申请(专利权)人：浙江省中医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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