麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体而言，公开了一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株及其应用。本发明专利技术提供的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，通过定点突变包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体中的麻疹病毒L蛋白上的甲基转移酶保守序列得到，可以降低拯救出来的麻疹病毒的复制能力，达到减弱病毒毒力的目的，且不会改变病毒的免疫原性。本发明专利技术提供的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，通过辅助质粒和上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救得到，该麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株致病力较低甚至高度致弱，同时能激发机体产生并维持高滴度的中和抗体，达到更好的免疫效果。

【技术实现步骤摘要】
麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株及其应用
本专利技术涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株及其应用。
技术介绍
麻疹病毒(Measlesvirus，MV)属于副粘病毒病毒科(Paramyxoviridae)，麻疹病毒属(Morbillivirus)，为不分节段的单股负链RNA病毒，病毒颗粒呈多形态或球形，外部由囊膜包裹。麻疹是麻疹病毒引起的严重威胁公众健康的急性传染病，能够引起严重的临床症状，甚至导致患者死亡，属于国家法定乙类传染病。国内所用的麻疹疫苗株为沪191(S191)株，沪191株生产的麻疹疫苗稳定性良好，其临床安全性和免疫原性均良好，有效性和安全性已经得到明确的肯定，是中国麻疹疫苗的主要生产株。麻疹疫苗接种能激发持久的免疫应答，带来长期的保护作用，遗传性稳定同时无致病性的返祖现象。但最初制备麻疹疫苗的工艺复杂，需要在不同的细胞系中传代许多次才能得到减毒的毒株，费时费力。同时，国内研究发现现有“沪191”麻疹疫苗对麻疹流行株保护能力正在下降，且接种疫苗株后仍会引起一定副反应，5％～15％的接种者会出现高于39℃的高热，5％的接种者会出现皮疹。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术提供了一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，可通过体外定点突变技术对该质粒载体中麻疹病毒基因组的任意位点进行致弱突变，缓解现有技术中制备的麻疹疫苗株费时、费力、病毒毒力较高等问题。为了解决接种麻疹疫苗后仍会引起一定副反应等问题，本专利技术提供了一种致病力进一步减弱的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，该疫苗株是以经典的麻疹病毒减毒株(S191)基因组为骨架，对其甲基转移酶区域进行突变后，结合辅助质粒拯救获得的重组疫苗。本专利技术提供了一种上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株在制备具有高免疫力的减毒麻疹疫苗中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术提供了一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，通过定点突变包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体中的麻疹病毒L蛋白上的甲基转移酶保守序列得到。进一步地，所述甲基转移酶保守序列为麻疹病毒结构蛋白中的L蛋白第VI保守区的氨基酸序列。进一步地，所述氨基酸序列包括K1766，G1788，G1790，G1792，D1881，K1917或E1954。进一步地，所述包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体为pYES-MV-S191。进一步地，对所述pYES-MV-S191中G1788，G1790或G1792氨基酸分别进行G到A的突变得到麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒pYES-MV-S191-G1788A、pYES-MV-S191-G1790A或pYES-MV-S191-G1792A。进一步地，用于制备pYES-MV-S191-G1788A质粒的引物为：G1788A-F：5’-gacggcttgttcttggctgagggatcgggttc-3’(SEQIDNO.1)；G1788A-R：5’-gaacccgatccctcagccaagaacaagccgtc-3’(SEQIDNO.2)；用于制备pYES-MV-S191-G1790A质粒的引物为：G1790A-F:5’-gttcttgggtgaggcatcgggttctatgttg-3’(SEQIDNO.3)；G1790A-R:5’-caacatagaacccgatgcctcacccaagaac-3’(SEQIDNO.4)；用于制备pYES-MV-S191-G1792A质粒的引物为：G1792A-F:5’-cttgggtgagggatcggcttctatgttgatcac-3’(SEQIDNO.5)；G1792A-R:5’-gtgatcaacatagaagccgatccctcacccaag-3’(SEQIDNO.6)。本专利技术还提供了一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，由辅助质粒pT7CFE1-N、辅助质粒pT7CFE1-P、辅助质粒pT7CFE1-L和上述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救得到；其中，辅助质粒pT7CFE1-N含有麻疹病毒的核衣壳蛋白编码基因；辅助质粒pT7CFE1-P含有麻疹病毒的磷蛋白编码基因；辅助质粒pT7CFE1-L含有麻疹病毒RNA聚合酶编码基因。本专利技术还提供了上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株在制备预防或治疗麻疹的疫苗中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，通过定点突变包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体中的麻疹病毒L蛋白上的甲基转移酶保守序列得到。用所述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救出来的麻疹病毒为甲基转移酶缺陷型，甲基转移酶活性受到抑制，由此影响病毒的帽甲基化结构的形成；从而实现降低拯救出来的病毒的复制能力及病毒蛋白表达水平，达到减弱病毒毒力的目的，且不会改变病毒的免疫原性。本专利技术提供的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，通过辅助质粒和上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救得到，该麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株致病力较低甚至高度致弱，同时能激发机体产生并维持高滴度的中和抗体，达到更好的免疫效果。附图说明图1为本专利技术实施例2中麻疹病毒分段扩增示意图；图2为本专利技术实施例2中N、P、M1、M2、F、H、L1和L2核苷酸序列片段PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳验证结果图；图3为本专利技术实施例4中辅助质粒pT7CFE1-N、pT7CFE1-P和pT7CFE1-L构建过程流程示意图；图4为本专利技术实施例5中麻疹病毒S191疫苗株的全长基因组质粒构建过程流程示意图；图5为本专利技术实施例5中麻疹病毒S191疫苗株的全长基因组质粒琼脂糖凝胶电泳验证结果图；图6A为本专利技术实施例6中麻疹病毒拯救检测的CPE结果图；图6B为本专利技术实施例6中麻疹病毒拯救检测的CPE结果图；图7为本专利技术实施例6中麻疹病毒拯救检测的测序结果图；图8为本专利技术实施例6中麻疹病毒拯救检测的间接免疫荧光法检测结果图；图9为本专利技术实施例7中麻疹病毒的甲基转移酶保守序列预测结果图；图10为本专利技术实施例9中rMV-S191-G1788A、rMV-S191-G1790A和rMV-S191-G1792A突变疫苗测序结果图；图11为本专利技术实施例10中rMV-S191、rMV-S191-G1788A、rMV-S191-G1790A和rMV-S191-G1792A的噬斑大小测定结果图；图12为本专利技术实施例12中rMV-S191、rMV-S191-G1788A和rMV-S191-G1792A一步生长曲线结果图；图13为本专利技术实施例12中rMV-S191、rMV-S191-G1788A和rMV-S191-G1792A不同时间点引起细胞病变的改变结果图；图14为本专利技术实施例13中rMV-S191、rMV-S191-G1788A和rMV-S191-G1792A对棉鼠致病力滴度实验研究结果图；图15A为本专利技术实施例14中rMV-S191、rMV-S191-G1788A和rMV-S191-G1792A接种棉鼠后四周的抗体中和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，通过定点突变包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体中的麻疹病毒L蛋白上的甲基转移酶保守序列得到。

【技术特征摘要】
1.一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，通过定点突变包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体中的麻疹病毒L蛋白上的甲基转移酶保守序列得到。2.根据权利要求1所述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，所述甲基转移酶保守序列为麻疹病毒结构蛋白中的L蛋白第VI保守区的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，所述氨基酸序列包括K1766，G1788，G1790，G1792，D1881，K1917或E1954。4.根据权利要求3所述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，所述包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体为pYES-MV-S191。5.根据权利要求4所述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，对所述pYES-MV-S191中G1788，G1790或G1792氨基酸进行G到A的突变得到麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒pYES-MV-S191-G1788A、pYES-MV-S191-G1790A或pYES-MV-S191-G1792A。6.根据权利要求5所述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，用于制备pYES-MV-S191-G1788A质粒的引物为：G1788A-F：5’-gacggcttgttcttggctgagggatcgggttc-3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵正言，黄耀伟，汪一龙，李建荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33