棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及棉花

【技术实现步骤摘要】
棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用
本专利技术属于基因工程
，涉及陆地棉基因GhVLN4在抗黄萎病中的应用。
技术介绍
棉花是全球重要的经济作物之一，在国民经济中占有重要地位。但棉花黄萎病在我国各棉区爆发成灾，已成为我国自枯萎病得到有效控制之后棉花生产上的第一大病害，是棉花可持续生产的主要障碍之一。目前常规的防治手段可以局部控制但不能有效防治，采用传统的抗病育种策略培育抗病品种成效缓慢，因此，从基因功能上进行分析，研究棉花抗黄萎病的机制，从分子水平上选育抗病品种是解决棉花黄萎病最有效的途径。在经过长期进化和自然选择后，植物形成了自己的一套抵御外界侵害的各种机制，包括植物所固有的先天性的抗性和受病原菌诱导所产生的各种防御机制。病原菌侵染植物后，病原菌的无毒基因所编码的无毒蛋白被植物的抗病基因识别而诱发抗病反应，其中的一个典型的症状是植物会发生超敏性的反应，引起侵染部位的细胞和组织坏死，从而阻止病原菌的扩散。这其中包括了氧爆发、细胞壁木质化、病程相关蛋白诱导表达以及植物抗毒素产生等；局部抗病反应的产生进而激活信号分子如水杨酸、茉莉酸、乙烯、脱落酸等介导的抗病反应，最终激发整个组织或植株的防卫反应。这些反应共同构成了植物抗病信号传导的几个主要途径：植物先天免疫系统信号路径，依赖R基因的信号传导路径，依赖水杨酸(SA)的系统获得性抗性信号路径和依赖茉莉酸(JA)和乙烯(ET)的诱导系统抗性信号路径。随着对微丝骨架的研究逐渐深入，越来越多的证据表明微丝骨架能够精确地调控植物对病原菌的防御反应。植物微丝骨架是一种高度动态变化的三维网络结构，它是由肌动蛋白单体(G-actin)多聚化形成纤维型肌动蛋白(F-actin)，再经过交联捆绑形成的高级结构。微丝结合蛋白通过调节微丝骨架不同形态之间的相互转换，参与植物应答病原菌侵染过程。拟南芥的加帽蛋白(cappingprotein,CP)参与拟南芥对多种病原相关分子模式(Pathogenormicrobe-associatedmolecularpatterns,PAMPs/MAMPs)的应答过程。小麦微丝解聚因子TaADF7通过调节微丝骨架动化变化，影响ROS积累和过敏性坏死来抵抗小麦条锈病。棉花微丝结构调控蛋白GhPFN2通过改变微丝骨架的高级结构以及增加微丝密度参与棉花应答大丽轮枝菌的侵染过程。但是关于微丝骨架与植物抗病之间的关系及其微丝结合蛋白质基因在植物抗病中的研究和应用都非常少。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供陆地棉基因GhVLN4在抗黄萎病中的新应用，利用该新途径，可培育新的抗黄萎病的棉花新品种，从而为棉花黄萎病的预防和控制提供新的抗性基因资源。绒毛蛋白(villin)是一种肌动蛋白结合蛋白，对微丝具有成核、切割、加帽、捆绑成束的作用。对于从肌动蛋白纤维丝形成更高级的形式并在真核细胞中的肌动蛋白动力学调控中起关键作用。水稻绒毛蛋白对于水稻株型其重要调控作用，但是目前还没有认识到其抗逆作用。专利技术人从棉花纤维中发现并克隆了一个绒毛蛋白编码基因，该蛋白除了促进植物细胞伸长之外，还发现该基因与棉花黄萎病抗性相关。沉默GhVLN4降低了棉花对大丽轮枝菌的抗性，在拟南芥中过表达可以提高对大丽轮枝菌侵染的耐受性。深入的探索棉花绒毛蛋白GhVLN4在抵抗大丽轮枝菌侵染过程中的作用机理，揭示了植物微丝骨架在植物免疫反应中的作用，不仅为棉花抗黄萎病分子机理研究提高新认识，同时该基因还可以应用于棉花抗黄萎病分子育种。本专利技术采用的技术方案详述如下。棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，所述GhVLN4基因，其全长cDNA序列为2886bp，GenBankID:KY112594，该基因与植物的黄萎病抗性相关；所述的植物天然含有GhVLN4基因。在受黄萎病菌侵染时，植物中GhVLN4基因的表达量发生升高。使植物中GhVLN4基因超表达，植物对黄萎病的抗性增强。植物在受到大丽轮枝菌和激素处理时，GhVLN4基因的表达量发生提高；所述的激素为SA水杨酸、ABA脱落酸、GA赤霉素和ET乙烯。在将GhVLN4基因沉默后，植物的黄萎病抗性降低，而将GhVLN4基因超表达后，植物对黄萎病抗性增加。具体地，棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，所述GhVLN4基因，GenBankID:KY112594.1，其ORF全长为2886bp，编码961个氨基酸，蛋白序列分析表明，其含有6个gelsolin结构域和1个VHP结构域。该基因在棉花的根、茎、叶、胚珠和纤维等组织中均有表达，但在茎和纤维中优势表达；同时该基因还受大丽轮枝菌V991，水杨酸，脱落酸，茉莉酸和乙烯利诱导上调表达，表明该基因与植物黄萎病抗性相关。亚细胞定位结果表明，该基因定位于微丝骨架。病毒介导的基因沉默(VIGS)实验表明：将GhVLN4基因沉默后，棉花对黄萎病抗性降低，发病率和病情指数升高；而将GhVLN4基因超表达后，植物对黄萎病的抗性增强，发病率和病情指数降低，所述植物为拟南芥等。本专利技术首先克隆获得了陆地棉GhVLN4基因，并对该基因及其编码的蛋白相关特性进行了深入研究。在对该基因与植物黄萎病相关研究时，专利技术人发现在植物受到黄萎病菌侵染时，该基因表达量显著升高，通过将该基因沉默后，植物对黄萎病抗性降低，而将该基因超表达后，植物对黄萎病抗性显著提高。基于上述研究结论，通过超表达GhVLN4基因，可以提高植物对黄萎病的抗性，为培育抗黄萎病新品种提供了新的抗病基因资源，因此，对于培育抗黄萎病植物新品种有重要的应用价值。附图说明图1为棉花GhVLN4基因菌液PCR检测的电泳图，其中M表示Marker，1和2表示2个单菌落；图2为棉花GhVLN4基因启动子序列顺式调控元件(图A)，基因结构(图B)，蛋白结构域(图C)以及蛋白质三级结构预测(图D)示意图；图3为棉花GhVLN4基因与拟南芥，水稻及百合VLN基因的进化树和结构域分析；其中GhVLN4，(KY112594)；AtVLN1，NP_029567(At2g29890)；AtVLN2，NP_565958(At2g41740)；AtVLN3，NP_567048(At3g57410)；AtVLN4，NP_194745(At4g30160)；AtVLN5，NP_200542(At5g57320)；LiABP135，AAD54660；LiABP115，BAC77209；OsVLN1，Os05g06110；OsVLN2，Os03g24220；OsVLN3，Os06g44890；OsVLN4，Os04g51440；和OsVLN5，Os08g14230；图4植物表达载体pBINPLUS-GhVLN4的PCR验证结果；其中M为Marker，1-5为菌液PCR检测，N为阴性对照，P为阳性对照；图5为GhVLN4在烟草叶片细胞的亚细胞定位结果，ABD2-mcherry为微丝骨架Maker；图6为GhVLN4在不同组织(根、茎、叶、胚珠、纤维)表达模式分析；图7为GhVLN4受黄萎病菌诱导时基因的表达变化情况；图8为激素诱导情况下基因的表达变化情况；图9为VIGS干扰植株对黄萎病的抗性分析结果，其中A:VIGS沉默棉花基因GhCLA1后的表型；B:TRV:00与TRV:GhVL本文档来自技高网...

【技术保护点】
棉花

【技术特征摘要】
1.棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，所述GhVLN4基因，其全长cDNA序列为2886bp，GenBankID:KY112594，该基因与植物的黄萎病抗性相关；所述的植物天然含有GhVLN4基因。2.如权利要求1所述棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，在受黄萎病菌侵染时，植物中GhVLN4基因的表达量发生升高。3.如权利要求1所述棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，使植物中GhVLN4基因超表达，植物对黄萎病的抗性增强。4.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘康，张培培，葛冬冬，张中起，韩明亚，张晓彤，吕芬妮，李丽凤，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32