一种基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测方法及系统技术方案

本发明专利技术属于数字微流控技术领域，具体为一种基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测方法，主要包括数字微流控芯片和表面增强拉曼探针两部分。上述的数字微流控芯片由上、下极板两部分组成。表面增强拉曼探针包括金属核、拉曼报告分子、壳层三部分，拉曼报告分子包埋在核壳结构之间。该方法基于介电润湿原理对电极阵列上的离散液滴进行自动化操纵，实现芯片上反应体系的构建，并实时快速地输出拉曼信号。本发明专利技术具有全自动处理、简单快速、灵敏度高、适用于复杂生物体系等优点，且可通过程序控制实现多个样本同时平行检测，可广泛应用于各种类型靶标的检测，尤其是稀有样本和传染性样本的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测方法及系统
本专利技术属于数字微流控
，主要涉及一种基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测方法。
技术介绍
数字微流控技术(DigitalMicrofluidics，DMF)是一种新兴的、基于介电润湿效应在微电极阵列上实现对单个离散的液滴精准操纵的微流控技术。通过分别对电极阵列上不同的电极施加电压，可以实现液滴的移动、生成、混合和分裂(1、Miller,E.M.；Ng,A.H.；Uddayasankar,U.；Wheeler,A.R.AnalBioanalChem2011,399,337-345；2、Choi,K.；Ng,A.H.；Fobel,R.；Wheeler,A.R.AnnuRevAnalChem2012,5,413-440.)。数字微流控芯片由于其灵活性高、重构性强，易于与其他技术如光学、电化学、质谱、核磁等技术结合，在蛋白质分析、细胞培养等方面得到了广泛应用，尤其适合步骤繁琐、多重复操作的免疫反应(3、Ng,A.H.；Choi,K.；Luoma,R.P.；Robinson,J.M.；Wheeler,A.R.AnalChem2012,84,8805-8812.)。基于数字微流控技术的免疫反应与一般大体积下的免疫分析方法相比优势在于：1、试剂消耗少：通过调控电极尺寸和芯片上、下极板的高度，液滴体积可控在纳升至微升的范围内；2、检测时间短：由于反应集中在纳升至微升的液滴里进行，扩散距离相比大体积降低了两个数量级，加之数字微流控技术特有的动态孵育技术，使得抗原、抗体分子更快接触免疫磁珠或者芯片表面，大大缩短免疫反应所需时间(4、Shamsi,M.H.；Choi,K.；Ng,A.H.；Wheeler,A.R.LabChip2014,14,547-554.)；3、自动化：自动化过程代替技术人员的操作，减小了人为误差，节省人力资源的同时得到重复、可信的结果，尤其适合传染性样本的检测。根据之前文献报道，数字微流控平台上的免疫分析方法一般以化学发光、荧光、电化学等技术作为检测手段(5、Ng,A.H.；Choi,K.；Luoma,R.P.；Robinson,J.M.；Wheeler,A.R.AnalChem2012,84,8805-8812；6、Emani,S.；Sista,R.；Loyola,H.；Trenor,C.C.,3rd；Pamula,V.K.；Emani,S.M.BloodCoagulFibrinolysis2012,23,760-768；7、Rackus,D.G.；Dryden,M.D.；Lamanna,J.；Zaragoza,A.；Lam,B.；Kelley,S.O.；Wheeler,A.R.LabChip2015,15,3776-3784.)。这些检测手段提供了准确、灵敏的分析结果，但也不可避免地存在一些局限性。酶的使用大大增加了检测成本，而且其不稳定性容易造成分析结果差异性大；荧光技术固有的光漂白的缺点，限制其检测灵敏度的提高；电化学分析手段虽然具有灵敏、低成本的优势，但数字微流控芯片上复杂的内置电极制作过程限制了其发展。因此，需要发展一种简单、低成本和高灵敏的检测分析技术。表面增强拉曼散射技术(SurfaceenhancedRamanscattering，SERS)作为一种分子振动光谱技术，可以精确反映单个分子的振动信息，被认为是一种超灵敏、非标记的检测分析技术(8、Wang,Y.；Yan,B.；Chen,L.ChemRev2013,113,1391-1428.)。由于其超高灵敏度、高分辨率、抗光漂白和不受水干扰等优势，由此技术发展产生的表面增强拉曼探针被广泛应用于DNA分析、蛋白质分析、生物成像等领域(9、Li,J.；Zhu,Z.；Zhu,B.；Ma,Y.；Lin,B.；Liu,R.；Song,Y.；Lin,H.；Tu,S.；Yang,C.AnalChem2016,88,7828-7836.)。显著的增强效应和均一的“热点”分布是表面增强拉曼探针应用于定量分析的关键。因此我们提出了一种以免疫分析为基础，结合自动化数字微流控平台和超灵敏表面增强拉曼散射技术的新方法以实现靶标的快速、灵敏、自动化定量检测。
技术实现思路
本专利技术提出一种结合数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测方法和系统，以实现复杂体系中痕量靶标的快速、灵敏、自动化定量分析。本专利技术的技术方案为：该靶标检测系统包括数字微流控芯片、表面增强拉曼探针、拉曼信号采集单元和用于靶标载体的磁珠四部分；其中，所述的数字微流控芯片由上、下极板两部分组成，下极板由下至上包括衬底、电极阵列、介质层和疏水层，上极板由上至下包括基底、导电层和疏水绝缘层；表面增强拉曼探针包括金属核、拉曼报告分子、壳层三部分，拉曼报告分子包埋在核壳结构之间。表面增强拉曼探针用于和磁珠孵育，使探针标记在形成免疫复合物的磁珠上；芯片上的洗涤过程是通过永久磁铁或者电磁铁固定芯片上的磁珠，通过操控电极将不包含磁珠的上清液移走至废液池。所述的金属核，优选为金核，所述的壳层，优选为银壳层。所述的电极阵列为基底上特定图案的金属电极阵列，包括贮液池电极、驱动电极和接触电极三部分，电极阵列通过金属蒸镀、光刻和湿法刻蚀技术得到；所述的介质层为介电性能好的、透明度高的、抗击穿能力强的介电材料；疏水层材料为特氟龙的水相分散液或者油相分散液。数字微流控芯片的上、下极板之间填充油，液滴浸润在油相中，以提高液滴能动性和防止液滴挥发。液滴中加入表面活性剂防止生物粘附，避免磁珠表面的蛋白以及液滴中的蛋白粘附芯片表面，提高液滴能动性及提高芯片的使用寿命。本专利技术的又一技术方案为：基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测方法，包括如下步骤：(1)免疫磁珠的准备：选择顺磁性磁珠作为固相载体，并包被相应的捕获抗体用于特异性捕获样品中的靶标；(2)芯片组装及上样：在数字微流控芯片上引入一个含有免疫磁珠的液滴，组装上极板并在芯片上、下极板之间填充油，分别在不同的贮液池引入洗液、样品、带有生物素标记的检测抗体、链酶亲和素和生物素化的表面增强拉曼探针液滴；(3)免疫反应：依次生成含有样品和检测抗体的液滴，相继与免疫磁珠进行动态孵育，形成磁珠-抗体-抗原-抗体免疫复合物，每次孵育后进行充分洗涤；(4)拉曼探针标记：依次生成含有链酶亲和素和表面增强拉曼探针的液滴，相继与磁珠进行动态孵育，探针标记在形成免疫复合物的磁珠上，每次孵育后进行充分洗涤；(5)拉曼信号采集：移走废液及贮液池中未反应的液滴，将芯片置于拉曼采集平台上进行信号采集。其中，步骤(3)和(4)中，液滴的生成通过依次控制贮液池电池和相邻驱动电极的通断电实现。芯片上的动态孵育步骤通过控制相应电极的通断电实现，设置程序使液滴在相邻的上、下、左、右四个相邻的电极上自动化循环往复运动。芯片上的洗涤过程是通过永久磁铁或者电磁铁固定芯片上的磁珠，通过操控电极将不包含磁珠的上清液移走至废液池，并从清洗液的贮液池中生成一个洗液液滴，对磁珠进行重悬混匀。其中，步骤(5)中，拉曼信号采集可采用大型拉曼仪器或者小型便携式拉曼采集仪。本专利技术数字微流控平台结合表面增强拉曼散射技术的方法有如下优势本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测系统，其特征在于，该检测系统包括数字微流控芯片、表面增强拉曼探针、拉曼信号采集单元和用于靶标载体的磁珠四部分，其中，所述的数字微流控芯片由上、下极板两部分组成，下极板由下至上包括衬底、电极阵列、介质层和疏水层，上极板由上至下包括基底、导电层和疏水绝缘层；表面增强拉曼探针包括金属核、拉曼报告分子、壳层三部分，拉曼报告分子包埋在核壳结构之间；表面增强拉曼探针用于和磁珠孵育，使探针标记在形成免疫复合物的磁珠上；芯片上的洗涤过程是通过永久磁铁或者电磁铁固定芯片上的磁珠，通过操控电极将不包含磁珠的上清液移走至废液池。

【技术特征摘要】
1.一种基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测系统，其特征在于，该检测系统包括数字微流控芯片、表面增强拉曼探针、拉曼信号采集单元和用于靶标载体的磁珠四部分，其中，所述的数字微流控芯片由上、下极板两部分组成，下极板由下至上包括衬底、电极阵列、介质层和疏水层，上极板由上至下包括基底、导电层和疏水绝缘层；表面增强拉曼探针包括金属核、拉曼报告分子、壳层三部分，拉曼报告分子包埋在核壳结构之间；表面增强拉曼探针用于和磁珠孵育，使探针标记在形成免疫复合物的磁珠上；芯片上的洗涤过程是通过永久磁铁或者电磁铁固定芯片上的磁珠，通过操控电极将不包含磁珠的上清液移走至废液池。2.根据权利要求1所述的基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测系统，其特征在于：所述的电极阵列为衬底上的金属电极阵列，包括贮液池电极、驱动电极以及接触电极三部分。3.根据权利要求1所述的基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测系统，其特征在于：所述的介质层为介电性能良好、透明度高、抗击穿能力强的介电材料；疏水层所用材料为特氟龙的水相分散液或者油相分散液。4.根据权利要求1所述的基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测系统，其特征在于：数字微流控芯片的上、下极板之间填充油。5.根据权利要求1所述的基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测系统，其特征在于：液滴中加入表面活性剂。6.一种基于数字微流控技术和表面增强拉曼散射技术的靶标检测方法，采用了权利要求1至5任一项所述的靶标检测系统，包括如下步骤：(1)免疫磁珠的准备：选择顺磁性磁珠作为固相载体，并包被相应的捕获抗体用于特异性捕获样品中的靶标；(2)芯片组装及上样...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，王杨，阮庆宇，郑萍萍，林水潮，朱志，周雷激，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35