一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法技术

本发明专利技术公开了一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法，包括如下步骤：步骤一：培养树鼩原代多巴胺神经元；步骤二：使用浓度为0.1‑1mM的METH诱导树鼩原代多巴胺神经元自噬，本发明专利技术测定了当METH浓度为0.5mM时能够诱导树鼩多巴胺神经元自噬，可以为下一步研究自噬信号及通路提供一个模型。

A method of METH inducing autophagy in primary cells of tree shrew dopaminergic neurons

The present invention discloses a method of METH inducing autophagy in the primary cell of tree shrew dopamine neurons, including steps: Step 1: to cultivate the primary dopamine neurons in tree shrews; step two: using the METH with a concentration of 0.1 to induce the autophagy of the primary dopamine neurons of tree shrews, which can be induced when the concentration of METH is 0.5mM. The autophagy of dopaminergic neurons in tree shrews can provide a model for further study of autophagy signals and pathways.

【技术实现步骤摘要】
一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法
本专利技术涉及成瘾的生物学
，具体涉及一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法。
技术介绍
甲基丙苯胺（Methamphetamine,METH）是一种依赖性极高的精神活性物质。长期大量使用可对神经系统产生显著的毒性作用。自噬是通过溶酶体途径对细胞内受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和浸入其内的病原体进行降解的过程。但是自噬异常与很多疾病相关，包括肿瘤、免疫性疾病和神经退行性疾病等。科研人员前期研究显示，吗啡成瘾过程中线粒体功能异常，进而诱发自噬。过度自噬却是细胞程序性死亡的一种方式，与神经退行性疾病密切相关。近年来，研究表明，自噬参与了METH神经毒性的发生发展，但自噬在METH神经毒性及其依赖机制中的作用目前尚未完全阐明，本专利用METH诱导新生树鼩原代多巴胺神经元自噬，并研究自噬的信号通路，从而为进一步的研究METH的自噬机制及神经毒性提供理论基础。
技术实现思路
为了解决上述背景中提到的问题，本专利技术目的在于提供一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法，解决因测试站包含所有的测试项，一次只能测试一个样品，测试站内部功能使用率低下导致测试时间冗长的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法，包括：步骤一：培养树鼩原代多巴胺神经元；步骤二：使用浓度为0.1—1mM的METH诱导树鼩原代多巴胺神经元自噬。培养树鼩原代多巴胺神经元包括：1）取新生3天内树鼩，麻醉后，于冰上无菌条件下取树鼩头部放于75%酒精浸泡5-10分钟，冰上取出完整大脑；2）将步骤1的大脑放入预冷的D-Hank’s液，去除软膜血管，剥离出海马、大脑皮质及中脑，用D-Hank’s液清洗后，用眼科剪将组织反复剪碎1—1.5mm，移入15ml离心管，2500转离心5分钟；3）将步骤2离心后弃上清，加入3ml0.25%胰酶消化液，转入T25细胞瓶，反复吹打后放入温箱消化15-20分钟；4）将步骤3消化后加入5ml培养液终止消化，所述培养液为高糖DMEM细胞培养基、5%FBS和1%双抗混合液，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/mlPDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为神经元专用培养基，所述神经元专用培养基为neurbasal培养基、2%B27、1%GlutamaxTM和1%双抗，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元；5）当细胞贴壁并长汇合度为为70-80%时，进行酪氨酸羟化酶（TH）及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定为多巴胺神经元。METH诱导树鼩多巴胺神经元自噬：1）配置有浓度分别为0，0.1mM，0.5mM，1mM的METH；2）当细胞生长汇合度为80%-90%时，用浓度分别为0mM、0.1mM、0.5mM、1mM的MET加入细胞培养液中，24小时后在光学显微镜下观察到细胞形态出现空泡；收集细胞，提取细胞中蛋白进行自噬标志蛋白LC3B和Beclin-1的测定。3）用浓度为0.5m的MMETH作用于原代细胞时间分别为0h、12h、24h、48h和72h，收集细胞后提取蛋白进行自噬标志蛋白LC3B和Beclin-1的测定。4）用浓度为0.5m的MMETH作用细胞24小时，收集细胞进行细胞超微结构的检测，与METH为0mM相比。5）用浓度为0.5m的MMETH作用细胞24小时，用4%多聚甲醛固定后进行LC3B和TH双免疫荧光标记，检测细胞中LC3B的表达。本专利技术测定了当METH浓度为0.5mM时能够诱导树鼩多巴胺神经元自噬，可以为下一步研究自噬信号及通路提供一个模型。附图说明图1是本专利技术不同浓度的METH作用于树鼩多巴胺神经元的形态变化对比图；图2是本专利技术不同浓度METH作用于树鼩原代多巴胺神经元效果对比图；图3是本专利技术不同浓度METH作用于树鼩原代多巴胺神经元自噬蛋白LC3B的表达；图4是本专利技术不同浓度METH作用于树鼩原代多巴胺神经元自噬蛋白Beclin-1的表达；图5是浓度为0.5m的METH作用于树鼩原代多巴胺神经元不同时间效果对比图；图6是浓度为0.5m的METH作用于树鼩原代多巴胺神经元不同时间自噬蛋白LC3B的表达；图7是浓度为0.5m的METH作用于树鼩原代多巴胺神经元不同时间自噬蛋白Beclin-1的表达；图8是本专利技术METH作用于树鼩原代神经元后的电镜图；图9是本专利技术METH作用树鼩原代神经元后LC3B的表达。具体实施方式为了更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图对本专利技术提供的实施例进行详细地描述。首先，培养树鼩原代多巴胺神经元1）取新生3天内树鼩，麻醉后，于冰上无菌条件下取树鼩头部放于75%酒精浸泡5-10分钟，冰上取出完整大脑；2）将步骤1的大脑放入预冷的D-Hank’s液，去除软膜血管，剥离出海马、大脑皮质及中脑，用D-Hank’s液清洗后，用眼科剪将组织反复剪碎1—1.5mm，移入15ml离心管，2500转离心5分钟；3）将步骤2离心后弃上清，加入3ml0.25%胰酶消化液，转入T25细胞瓶，反复吹打后放入温箱消化15-20分钟；4）将步骤3消化后加入5ml培养液终止消化，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/mlPDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为新的神经元专用培养基，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元；5）当细胞贴壁并长至70-80%时，进行酪氨酸羟化酶（TH）及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定为多巴胺神经元。然后，METH诱导树鼩多巴胺神经元自噬：配置有浓度分别为0，0.1mM，0.5mM，1mM的METH。用浓度分别为0,0.1mM,0.5mM,1mM的METH作用于细胞，24小时后在光学显微镜下观察到细胞形态出现空泡，以METH浓度为0.5mM时最为明显，如附图1所示；当METH作用细胞24小时后，收集细胞，提取细胞中蛋白进行自噬标志蛋白LC3B和Beclin-1的测定，发现细胞中加入METH24小时后，LC3B和Beclin-1蛋白表达水平均有上调，其中当METH浓度为0.5mM时，LC3B和Beclin-1蛋白表达水平上调最为明显，与METH为0mM相比，分别增加了1.14倍和1.12倍，如附图2所示。用浓度为0.5m的MMETH作用于原代细胞时间分别为0h、12h、24h、48h和72h，收集细胞后提取蛋白进行自噬标志蛋白LC3B和Beclin-1的测定，METH诱导自噬蛋白LC3B和Beclin-1蛋白质水平的表达，与0h相比，12h时分别增加了2.25倍和2.97倍，而24h后两种蛋白表达水平最高，分别增加了5.13倍和5.03倍，如附图3所示。用浓度为0.5m的MMETH作用细胞24小时，收集细胞进行细胞超微结构的检测，与METH为0mM相比，加入METH0.5mM后，双层或多层膜结构的自噬体明显增多，如附图4所示。用浓度为0.5m的MMETH作用细胞24小本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：培养树鼩原代多巴胺神经元；步骤二：使用浓度为0.1—1mM的METH诱导树鼩原代多巴胺神经元自噬。

【技术特征摘要】
1.一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：培养树鼩原代多巴胺神经元；步骤二：使用浓度为0.1—1mM的METH诱导树鼩原代多巴胺神经元自噬。2.根据权利要求1所述的一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法，其特征在于，步骤一包括以下步骤；1）取新生3天内树鼩，麻醉后，于冰上无菌条件下取树鼩头部放于75%酒精浸泡5-10分钟，冰上取出完整大脑；2）将步骤1的大脑放入预冷的D-Hank’s液，去除软膜血管，剥离出海马、大脑皮质及中脑，用D-Hank’s液清洗后，用眼科剪将组织反复剪碎1—1.5mm，移入15ml离心管，2500转离心5分钟；3）将步骤2离心后弃上清，加入3ml0.25%胰酶消化液，转入T25细胞瓶，反复吹打后放入温箱消化15-20分钟；4）将步骤3消化后加入5ml培养液终止消化，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/mlPDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为神经元专用培养基，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元细胞；5）当细胞贴壁并长至汇合度为70-80%时，进行酪氨酸羟化酶（TH）及Nest...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾晓锋，李娟，代解杰，李桢，杨根梦，张冬先，张瑞林，洪仕君，李树华，王尚文，何永旺，周一卿，黄俭，王一航，
申请(专利权)人：昆明医科大学，中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53