尼群地平半抗原、人工抗原及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种尼群地平半抗原、人工抗原及其制备方法，旨在提供一种既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的尼群地平基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别，所述的尼群地平半抗原结构式如式1

Nitrendipine hapten, artificial antigen and preparation method thereof

The present invention discloses a nitrendipine semi antigen, an artificial antigen and a preparation method, which aims to provide a basic structure of nitrendipine, which is both beneficial to coupling with large molecules, and can fully expose its molecular structure and molecular weight after coupling, and avoids the identification of animal body by the masking of large subdivisions. The structural formula 1 of the nitrendipine semi antigen

【技术实现步骤摘要】
尼群地平半抗原、人工抗原及其制备方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及尼群地平半抗原、人工抗原及其制备方法。
技术介绍
尼群地平(Nitrendpine)，2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-1,4-二氢-3,5-吡啶二甲酸甲乙酯，其化学式为C21H18N4O4，可作用于肠平滑肌，使肠蠕动增加，同时又能抑制肠道内水分的吸收，使水和电解质在结肠蓄积，产生缓泻作用，临床常用于治疗用于冠心病及高血压，尤其是患有这两种疾病的患者，也可用于充血性心力衰竭。但尼群地平具有一定的不良反应，包括：由尼群地平引起的，较少见的有头痛、面部潮红。少见的有头晕、恶心、低血压、足踝部水肿、心绞痛发作，一过性低血压。本品过敏者可出现过敏性肝炎、皮疹，甚至剥脱性皮炎等。禁忌症包括对本品过敏及严重主动脉瓣狭窄的患者。药物过量或长期滥用时能够导致过度的外周血管扩张，继发或延长体循低血压状态。肝功能不全的患者药物清除率下降。近年来，降压药中药或保健品中非法添加尼群地平以达到临床的疗效的新闻屡见报道。如果患者在长期不知情的情况下服用含有尼群地平的中成药或保健品会引起严重的副作用。因此，急需开发快速准确的尼群地平检测手段和方法用于监管执法和科学研究。目前，检测中成药或保健品中是否含有尼群地平成分，采用的是传统的检验方法，须将提取的样品带回实验室进行大型仪器分析耗时长，成本高。免疫分析是一种基于抗原抗体特异性识别和结合反应的分析方法，具有灵敏、对仪器要求不高、操作简单、成本低等优点。尼群地平属于分子量小于1000的小分子化合物，本身不具备反应性和免疫原性，为了实现尼群地平的免疫检测，不仅需要合成具备高效价的尼群地平抗原，而且还需要筛选特异性强、敏感度高的尼群地平单克隆抗体。但是目前尚未有有关尼群地平单克隆抗体的相关报道。对于技术人员来说高效价的尼群地平抗原的设计仍是难点。
技术实现思路
针对上述的问题，本专利技术的第一个目的提供一种尼群地平半抗原；本专利技术的第二个目的是提供一种尼群地平半抗原的制备方法；本专利技术的第三个目的是提供一种尼群地平人工抗原，该人工既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的尼群地平基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别；本专利技术的第四个目的是提供一种尼群地平人工抗原的制备方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供第一个技术方案是这样的：一种尼群地平半抗原，其分子结构式如下式1所示：其中，n为1、2或3，式1。本专利技术提供的第二个技术方案是这样的：上述尼群地平半抗原的制备方法，采用被硝基还原后的尼群地平氢生物与环状酸酐反应，得到尼群地平半抗原；所述的尼群地平氢生物，其分子结构式如下式2所示：进一步的，上述尼群地平半抗原的制备方法，依次包括如下步骤：1)将尼群地平、2～3份的催化剂铁粉溶解于30份的乙酸乙酯中，在弱酸条件，温度100～110℃搅拌反应11-13h，经分离得到尼群地平氢生物；2)将步骤1)制备的尼群地平氢生物与环状酸酐加入四氢呋喃中，在弱碱性条件下，温度40-60℃下反应11～13h，得到尼群地平半抗原。进一步的，上述的尼群地平半抗原的制备方法，所述环形酸酐为丁二酸酐或戊二酸酐或己二酸酐。进一步的，上述尼群地平半抗原的制备方法，步骤3)是将尼群地平、铁粉以及氯化铵混合，在乙酸乙酯溶液中加热至100℃搅拌反应12h，产物中加入过量乙酸乙酯，将析出的固体溶解；抽滤，去除铁粉，减压抽滤并收集固体，干燥得到尼群地平的还原产物即尼群地平氢生物。本专利技术提供的第三技术方案是这样的：一种尼群地平人工抗原，分子结构式如式3所示：其中，n为1、2或3；式3。本专利技术的第四个技术方案是这样的：上述的尼群地平人工抗原的制备方法，包括如下步骤：1)将尼群地平半抗原、EDC、NHS在有机溶剂中15～30℃、避光条件下搅拌反应24～26h，得到一号反应液；2)将1重量份载体蛋白BSA与20～30份磷酸缓冲液混合，得到二号反应液；3)将步骤1)所得的一号反应液与步骤2)所得的二号反应液，在15～30℃、避光条件下搅拌反应30～60min，然后在3～5℃、避光条件下搅拌反应24～26h，得到所述尼群地平人工抗原；所述的载体蛋白BSA与尼群地平半抗原的质量比为1：10～15。进一步的，上述的尼群地平人工抗原的的制备方法，步骤1)所述有机溶剂为DMF。进一步的，上述的尼群地平人工抗原的的制备方法，所述的纯化将反应液进行离心处理，并将上清液置于装有pH值为7.0～7.5磷酸盐缓冲液的分子截留为20000～30000的透析袋中，在3～5℃的条件下进行透析56～60小时，每隔8～10小时换一次磷酸盐缓冲液，保留透析袋中所得溶液，经冷冻干燥得白色固体。本专利技术提供了尼群地平半抗原M2、人工抗原M2-BSA及其制备方法。本专利技术以尼群地平M为原料，在铁粉的催化下，经过还原得到M1，并进一步与环状酸酐反应，得到尼群地平衍生物(半抗原M2)。该半抗原在保留尼群地平基本结构的基础上引入连接臂(linker)结构和用于偶联大分子的活性基团，这样既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量(360)较小的尼群地平基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。本专利技术通过活性酯化法将半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原，偶联比可达16.8，可用于尼群地平的免疫检测。此方法获得的人工合成抗原可进一步制备抗体，运用到胶体金试纸中，此胶体金试纸可用于食品保健品非法添加尼群地平类化合物的快速筛查。附图说明图1示试验例1中BSA、尼群地平半抗原、尼群地平半抗原-BSA的紫外全波谱扫描图；具体实施方式本专利技术公开了尼群地平半抗原、人工抗原及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的尼群地平半抗原、人工抗原及其制备方法的反应机理为：其中n＝1，2，3。在本专利技术提供的实施例中，如上式所示半抗原M2的制备方法包括步骤：将10g尼群地平M、2g的铁粉与2g氯化铵混合后，溶解于30g的乙酸乙酯中，pH值约为6.0，110℃搅拌反应11-13h。产物中加入过量乙酸乙酯，将析出的固体溶解；抽滤，去除铁粉，减压抽滤并收集固体，干燥得到尼群地平的还原产物M1。将1gM1与3g环状酸酐混合后，溶解于30g的四氢呋喃中，然后逐滴加入6滴三乙胺，pH值约为8.0，40～60℃搅拌反应11～13h。反应结束后，将反应液减压浓缩，并重新溶解于乙酸乙酯，调至弱酸性，减压浓缩后得到固体，干燥得到尼群地平半抗原M2。在本专利技术提供的实施例中，如上式所示人工抗原M2-BSA的制备方法包括步骤：1)将如上式所示的半抗原M2、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N—二甲基甲酰胺(DMF)平衡至室温；2)将1g半抗原M2、10gEDC和10gNHS混合于圆底烧瓶，加入DMF，待所有物质溶解后，室温避光下搅拌12h，生成溶液记为一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种尼群地平半抗原，其特征在于，其分子结构式如下式1所示：

【技术特征摘要】
1.一种尼群地平半抗原，其特征在于，其分子结构式如下式1所示：其中，n为1、2或3，式1。2.权利要求1所述的尼群地平半抗原的制备方法，其特征在于，采用被硝基还原后的尼群地平氢生物与环状酸酐反应，得到尼群地平半抗原；所述的尼群地平氢生物,其分子结构式如下式2所示：式2。3.根据权利要求2所述的尼群地平半抗原的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：1)将尼群地平、催化剂铁粉溶解于的乙酸乙酯中，在弱酸条件，温度100～110℃搅拌反应11-13h，经分离得到尼群地平氢生物；2)将步骤1)制备的尼群地平氢生物与环状酸酐加入四氢呋喃中，在弱碱性条件下，温度40-60℃下反应11～13h，得到尼群地平半抗原；所述尼群地平氢生物、环形酸酐的质量比为1：3～6。4.根据权利要求2所述的尼群地平半抗原的制备方法，其特征在于，步骤3)是将尼群地平、铁粉以及氯化铵混合，在乙酸乙酯溶液中加热至100℃搅拌反应12h，产物中加入过量乙酸乙酯，将析出的固体溶解；抽滤，去除铁粉，减压抽滤并收集固体，干燥得到尼群地平的还原产物即尼群地平氢生物。5.根据权利要求2所述的尼群地平半抗原的制备方法，所述环形酸酐为丁二酸酐或戊二酸酐或己二酸酐。6.根据权利要求2所述的尼群地平半抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢宇靖，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44