利用重测序技术快速确定转基因株系插入位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法，包括以下步骤：1)、提取转基因株系基因组DNA，总量至少2g；2)、进行基因组重测序，数据量至少12G；3)、利用转基因载体T‑DNA序列作为模板，对得到的测序数据进行比对分析，得到插入位点的信息；4)、根据插入位点的信息设计引物，进行PCR验证；从而确定每个转基因株系的插入位点。利用本发明专利技术的方法确定转基因株系插入位点具有方法成熟、简单，成功率高的特点，可以广泛应用于转基因株系的插入位点确定。

Rapid determination of insertion sites of transgenic lines using re sequencing technology

The invention discloses a method for determining the insertion site of a transgenic line by using the heavy sequencing technology, including the following steps: 1), extracting the genome DNA of the transgenic line, the total amount is at least 2G; 2), the genome is re sequenced, the amount of data is at least 12G; 3), and the sequence of the DNA sequence of the transgenic carrier T is used as the template. According to the comparison analysis, the information of the insertion site was obtained; 4) the primers were designed according to the information of the insertion site, and the PCR verification was carried out to determine the insertion site of each transgenic line. The method of using this method to determine the insertion site of transgenic lines has the characteristics of maturity, simplicity and high success rate, and can be widely used in determining the insertion site of transgenic lines.

【技术实现步骤摘要】
利用重测序技术快速确定转基因株系插入位点的方法
本专利技术属于植物基因工程领域。具体的说，本专利技术涉及一种利用重测序技术快速确定转基因株系插入位点新方法。
技术介绍
目前应用于侧翼序列分离的方法有很多，主要有SON-PCR、TAIL-PCR及接头-PCR等，最近又出现一种利用DNA捕获技术获得侧翼序列的方法。SON-PCR和TAIL-PCR是基于热不对称原理专利技术的PCR方法，这两种方法由于第二链合成的随机性，以及转基因株系大多不是单拷贝的缘故，造成引物匹配混乱，导致获得有用片段的效率不高；接头-PCR方法可以大大提高有效片段的获得，现已公布了三种接头-PCR获得侧翼序列的方法，但都存在一些缺点，如：有的方法采用平端连接接头，使得连接效率低，不利于后期的PCR扩增；有的方法虽然使用黏性末端接头，提高了连接效率，但可供选择的酶的种类有限，适用范围不广，通用性不高；利用DNA捕获技术获得侧翼序列的方法，操作要求高，步骤繁琐，对技术要求很高，导致成功率低。而侧翼序列的获得对目前植物转基因应用领域非常重要，迫切需要得到一种操作简单、步骤少、成功率高的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可靠、高通量和快速确定转基因株系插入位点的新技术，即，提供一种利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法。利用该技术确定转基因株系插入位点具有方法成熟、简单，成功率高的特点，可以广泛应用于转基因株系的插入位点确定。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法，包括以下步骤：1)、提取转基因株系(农杆菌介导的转基因株系)基因组DNA，总量至少2g；2)、进行基因组重测序，数据量至少12G；3)、利用转基因载体T-DNA序列作为模板，对得到的测序数据进行比对分析，得到插入位点的信息；4)、根据插入位点的信息设计引物，进行PCR验证；从而确定每个转基因株系的插入位点。作为本专利技术的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法的改进：步骤1)中提取基因组DNA的方法为CTAB法。作为本专利技术的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法的进一步改进：所述步骤2)为：将步骤1)所得的基因组等比例混合后，按照常规基因组二代测序技术进行基因组的重测序，DNA建库长度200-300bp，每个Reads长度150bp，至少得到12G的数据。作为本专利技术的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法的进一步改进：所述步骤3)中序列比对分析所用软件为bowtie2，默认设置。作为本专利技术的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法的进一步改进：所述步骤3)为：以转基因载体序列(至少包含一个边界序列)为参考基因组进行同源性分析，根据分析的结果，提取一端匹配到载体序列，另一端未匹配的reads序列；未匹配的reads序列以水稻基因组序列，采用blast软件进行同源性比对分析，根据比对结果设计引物进行后续验证。作为本专利技术的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法的进一步改进：所述步骤4)中PCR验证方法为常规PCR方法。本专利技术利用的技术涉及DNA提取、PCR反应、基因组重测序等，都是目前分子生物学的成熟技术。与现有技术相比，本专利技术至少有以下技术优势：1)、本专利技术利用全基因组重测序(步骤2)，并利用转基因载体序列进行分析比对的方法得到插入位点，克服了现有侧翼序列分离技术效率低、操作复杂和通量低的缺点，而且不受拷贝数的影响，具有操作过程简单、高效、经济实用等特点。2)、本专利技术既可以应用于大规模T-DNA插入位点分析，又可以用于转基因安全管理中的侧翼位点分析。综上所述，本专利技术通过使用常规、易操作的分子生物学技术和分析量极小的生物信息学分析，得到插入位点信息，避免了复杂、成功率低的操作和大量的生物信息学分析，方法门槛低，成功率高，应用广泛。附图说明下面结合附图对理解本专利技术作进一步的详细描述，但并非对专利技术作限定。图1转基因载体图谱。图2为3个转基因株系DNA提取后电泳图。图3为3个转基因株系G9A基因PCR结果。图4为分析得到的2号染色体插入位点信息(深色为载体序列)。图5为分析得到的7号染色体插入位点信息(深色为载体序列)。图6为分析得到的9号染色体插入位点信息(深色为载体序列)。图7为分析得到的11号染色体插入位点信息(深色为载体序列)。图8为插入位点PCR验证。图9为3个转基因株系Southernblot结果。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克与D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社出版，2002年8月第三版)中所述条件执行。一种利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法，依次进行以下步骤：1)、转基因株系基因组DNA提取。取3个转基因株系A，B，C，转基因载体35S-1300-G9A图谱见图1，载体含有的转基因抗性筛选位点为草甘膦抗性，载体T-DNA插入序列见SEQIDNO:1。A，B，C株系正常培养到30天苗龄后，分别取叶片100mg，提取基因组DNA，并测定DNA浓度，DNA提取结果见图2。A，B，C3个株系利用G9A引物做PCR验证结果见图3。2)、基因组重测序把3份基因组DNA按照浓度等比例混合，按照常规水稻基因组重测序技术进行处理，上机重测序(进行全基因组重测序)，DNA建库长度200-300bp，每个Reads长度150bp，测序数据量为12G(水稻基因组总量为400M，12G为基因组总量的30倍)。3)、测序数据分析根据基因组重测序结果，使用转基因载体35S-1300-G9A中Leftborder和Rightborder之间的序列作为模板，对测序得到的全部序列使用bowtie2软件(默认设置)进行筛选，会得到一类序列，其特点是一半为能与载体序列匹配，一半不能匹配的read序列，不匹配的序列即为基因组序列，把得到的不匹配的序列(基因组序列)在网站：http://rice.plantbiology.msu.edu/standalone_blast.shtml上进行序列同源性比对(默认设置)，得到其在基因组上的具体位置。本实施例共得到4个位置(图4，5，6，7)。bowtie2软件网站：http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml。4)、PCR验证根据步骤3)得到的序列信息，设计PCR引物，利用A，B和C的基因组DNA进行PCR分析，结果见图8，PCR阳性的引物所代表的位置即为该转基因株系T-DNA的插入位点。实施例1、1)、随机取3个转基因株系A，B，C(均为使用转基因载体35S-1300-G9A通过农杆菌转基因获得的转基因株系)，正常培养30天后，各取100mg叶片，经液氮碾磨后，加入1000μL80℃1.5×CTAB(15gCTAB；75ml1MTris-HCl,pH8.0；30ml0.5MEDTA，pH8.0；61.4gNaCl；定容1L，搅拌子搅拌溶解2h)；65℃水浴30min；加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1的体积比)缓慢上下颠倒约15min，直至下层液相呈深绿色为止本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法，其特征是包括以下步骤：1)、提取转基因株系基因组DNA；2)、进行基因组重测序；3)、利用转基因载体T‑DNA序列作为模板，对得到的测序数据进行比对分析，得到插入位点的信息；4)、根据插入位点的信息设计引物，进行PCR验证；从而确定每个转基因株系的插入位点。

【技术特征摘要】
1.利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法，其特征是包括以下步骤：1)、提取转基因株系基因组DNA；2)、进行基因组重测序；3)、利用转基因载体T-DNA序列作为模板，对得到的测序数据进行比对分析，得到插入位点的信息；4)、根据插入位点的信息设计引物，进行PCR验证；从而确定每个转基因株系的插入位点。2.根据权利要求1所述的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法，其特征是：所述步骤1)中，DNA总量至少2g；所述步骤2)中，数据量至少12G。3.根据权利要求1或2所述的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法，其特征是：步骤1)中提取基因组DNA的方法为CTAB法。4.根据权利要求1或2所述的利用重测序技术确定转基因株系插入位点的方法，其特征是：所述步骤2)为：将步骤1)所得的基因组等比例混合后，按照...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐纪明，胡晗，毛文轩，毛传澡，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33