甘薯蛋白多肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了甘薯蛋白多肽的制备方法，属于蛋白多肽制备技术领域，制备方法包括预处理、冻融破壁、蛋白酶共固定化、酶解、超滤纯化和冷冻干燥，其特征在于：所述的冻融破壁操作为：取预处理液，按质量体积比为1g:0.8~1.5ml加入超纯水，在‑30~‑12℃下冷冻40~70min，后在5~10℃下解冻，反复冻融1~5次，冻融结束后在8~16℃下离心，取上清液保存。该方法对原料的利用率高、成本低廉、操作简单，制备所得的蛋白多肽的分子量小、活性高、纯度高，适用范围广，可在食品、化妆品、保健品行业应用。

Preparation of protein polypeptide of sweet potato

The invention discloses a preparation method of the protein polypeptide of sweet potato, which belongs to the technical field of the preparation of protein and polypeptide. The preparation methods include pretreatment, freezing and thawing wall, protease co immobilization, enzymolysis, ultrafiltration purification and freeze drying. The characteristics are as follows: the freezing and thawing breaking operation is: Taking the pretreatment solution, according to the mass volume ratio of 1g:0.8~1 .5ml was added to the ultra pure water at 12 degrees centigrade and frozen 40~70min, then thawing at 5~10, freezing and thawing for 1~5 times. After freezing and thawing at the end of freezing and thawing, it was centrifuged at 8~16 C, and the supernatant was preserved. This method has high utilization ratio, low cost and simple operation. The molecular weight, high activity, high purity and wide range of molecular weight of the protein peptides obtained from the preparation can be applied in food, cosmetics and health care products.

【技术实现步骤摘要】
甘薯蛋白多肽的制备方法
本专利技术属于蛋白多肽制备
，具体涉及甘薯蛋白多肽的制备方法。
技术介绍
甘薯（学名：Dioscoreaesculenta(Lour.)Burkill）：又名甜薯，旋花科薯蓣属缠绕草质藤本。地下块茎顶分枝末端膨大成卵球形的块茎，外皮淡黄色，光滑。茎左旋，基部有刺，被丁字形柔毛。单叶互生，阔心脏形；雄花序为穗状花序，单生，雄花无梗或具极短的梗；苞片卵形，顶端渐尖；花被浅杯状，被短柔毛；蒴果三棱形，顶端微凹，基部截形，每棱翅状；种子圆形，具翅。花期初夏。甘薯蛋白含有丰富的氨基酸，其中8中人体必须的氨基酸含量均高于其他许多植物，具有很高的营养价值，由于未变形的甘薯蛋白具有胰蛋白酶抑制活性，影响其消化吸收，如成为小分子量的肽，会提升其生物价值，因此，如何制备具有高活性且分子量小的甘薯蛋白多肽是目前的研究重点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种甘薯蛋白多肽的制备方法，该方法对原料的利用率高、成本低廉、操作简单，制备所得的蛋白多肽的分子量小、活性高、纯度高，适用范围广。本专利技术为解决上述技术问题所采取的方案为：甘薯蛋白多肽的制备方法，包括预处理、冻融破壁、蛋白酶共固定化、酶解、超滤纯化和冷冻干燥，本专利技术的制备方法简单，成本低，重现性好，原料利用率高，制备所得的蛋白多肽分子量介于3~5kDa之间，分子量小且活性高，可在食品、化妆品、保健品等行业中应用。作为优选，预处理操作为：取甘薯洗净去皮，粉碎后加入3~5倍体积超纯水浸提，浸提1~3次后合并浸提液，离心取上清液，得预处理液。采用超纯水浸提，甘薯中的有效成分收集率高，且去除茎、块等不易后续操作的物质。作为优选，冻融破壁操作为：取预处理液，按质量体积比为1g:0.8~1.5ml加入超纯水，在-30~-12℃下冷冻40~70min，后在5~10℃下解冻，反复冻融1~5次，冻融结束后在8~16℃下离心，取上清液保存。采用冻融破壁的方法对预处理液进行细胞破壁，不易造成蛋白质变性，其原理为利用冷冻条件下细胞内形成的冰粒以及细胞液的盐浓度增高而引起的溶胀从而使细胞破碎蛋白溶出。本专利技术中冻融破壁条件为最佳控制条件，对细胞内容物的提取率最高，对蛋白质变性影响最小。作为优选，蛋白酶共固定化操作为：取壳聚糖粉末，用磷酸盐缓冲液浸泡过夜，后经活化偶联，加入胰蛋白酶溶液和弹性蛋白酶溶液，于冰浴中缓慢搅拌0.7~1.9h，后冷藏18~27h，用蒸馏水彻底冲洗，过滤干燥得到壳聚糖固定化复合酶。蛋白酶共固定化操作可将酶限制在一定区域内，进行特有的、活跃的催化作用，酶固定化操作后其稳定性更高，且回收方便，可有效提高酶解程度，提高原料的利用率，减低制备成本。作为优选，磷酸盐缓冲液的浓度为50~76mmol/L、pH6.3~6.9。上述所采用磷酸盐缓冲液具有最佳的浓度与pH，可提升壳聚糖物化性质，便于后续的酶固定。作为优选，活化操偶联作为：按与壳聚糖粉末质量比为1:0.1~0.3加入甲基对甲苯基亚砜，在26~30℃下活化0.3~0.6h，后加入壳聚糖粉末体积的0.8~1.5倍的戊二醛进行1.5~2.1h的偶联反应。甲基对甲苯基亚砜中的(R)-(+)-甲基对甲苯基亚砜和(S)-(-)-甲基对甲苯基亚砜的质量比为1:0.2，活化操作中加入的甲基对甲苯基亚砜可对壳聚糖进行化学改性，有效活化壳聚糖表面羟基基团。活化后的壳聚糖表面氨基与戊二醛偶联得到优良的胰蛋白酶和弹性蛋白酶固定化载体，便于胰蛋白酶和弹性蛋白酶的吸附，提高酶固定化操作的固定率，使极多的胰蛋白酶和弹性蛋白酶吸附在载体上形成壳聚糖固定化复合酶，提升所制得的壳聚糖固定化复合酶的活跃性。作为优选，酶解操作为：取冻融破壁所得的上清液，按质量体积比为1:0.2~0.5加入壳聚糖固定化复合酶，后在pH5.3~7.2，温度为38~55℃下酶解1.2~3.5h，水浴灭酶，过滤，得酶解液。采用吸附有胰蛋白酶和弹性蛋白酶的壳聚糖固定化复合酶进行酶解，在酶解过程中胰蛋白酶和弹性蛋白酶的水解位点可产生协同作用，提高对上清液中有效成分的水解程度，使水解所得的蛋白多肽的分子量小、纯度高。上述控制的酶解条件为最佳酶解条件，壳聚糖固定化复合酶的活性强，酶解效率高。作为优选，冷冻干燥条件为：温度-20~-10℃，真空度8~12Pa。采用冷冻干燥对制得的蛋白多肽的化学组成和物理性质的影响小，使制得所得的蛋白多肽的活性高，生物价值好。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为:1）采用冻融破壁的方法对预处理液进行细胞破壁，不易造成蛋白质变性，其原理为利用冷冻条件下细胞内形成的冰粒以及细胞液的盐浓度增高而引起的溶胀从而使细胞破碎蛋白溶出；2）活化操作中加入的甲基对甲苯基亚砜可对壳聚糖进行化学改性，有效活化壳聚糖表面羟基基团。活化后的壳聚糖表面氨基与戊二醛偶联得到优良的胰蛋白酶和弹性蛋白酶固定化载体，便于胰蛋白酶和弹性蛋白酶的吸附，提高酶固定化操作的固定率，使极多的胰蛋白酶和弹性蛋白酶吸附在载体上形成壳聚糖固定化复合酶，提升所制得的壳聚糖固定化复合酶的活跃性；3）在酶解过程中胰蛋白酶和弹性蛋白酶的水解位点可产生协同作用，提高对上清液中有效成分的水解程度，使水解所得的蛋白多肽的分子量小、纯度高。具体实施方式以下结合实施例作进一步详细描述：实施例1：甘薯蛋白多肽的制备方法，包括预处理、冻融破壁、蛋白酶共固定化、酶解、超滤纯化和冷冻干燥，本专利技术的制备方法简单，成本低，重现性好，原料利用率高，制备所得的蛋白多肽分子量介于3~5kDa之间，分子量小且活性高，具体制备步骤如下：1）预处理：取甘薯洗净去皮，粉碎后加入3倍体积超纯水浸提，浸提1次后合并浸提液，离心取上清液，得预处理液；2）冻融破壁：取预处理液，按质量体积比为1g:0.8ml加入超纯水，在-30℃下冷冻40min，后在5℃下解冻，反复冻融1次，冻融结束后在8℃下离心，取上清液保存；3）蛋白酶共固定化：取壳聚糖粉末，用磷酸盐缓冲液浸泡过夜，后经活化偶联，加入胰蛋白酶溶液和弹性蛋白酶溶液，于冰浴中缓慢搅拌0.7h，后冷藏18h，用蒸馏水彻底冲洗，过滤干燥得到壳聚糖固定化复合酶，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L、pH6.3，活化操偶联作为：按与壳聚糖粉末质量比为1:0.1加入甲基对甲苯基亚砜，在26℃下活化0.3h，后加入壳聚糖粉末体积的0.8倍的戊二醛进行1.5h的偶联反应，甲基对甲苯基亚砜中的(R)-(+)-甲基对甲苯基亚砜和(S)-(-)-甲基对甲苯基亚砜的质量比为1:0.2；4）酶解：取冻融破壁所得的上清液，按质量体积比为1:0.2加入壳聚糖固定化复合酶，后在pH5.3，温度为38℃下酶解1.2h，水浴灭酶，过滤，得酶解液；5）超滤纯化：将酶解液加入至超滤离心管中，在3℃、5000r/min下离心5min，得甘薯蛋白多肽；6）冷冻干燥条件为：取甘薯蛋白多肽，在温度-20℃，真空度8Pa下进行冷冻干燥，的甘薯蛋白多肽粉末。本实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。实施例2：甘薯蛋白多肽的制备方法，具体制备步骤如下：1）预处理：取甘薯洗净去皮，粉碎后加入4倍体积超纯水浸提，浸提2次后合并浸提液，离心取上清液，得预处理液；2）冻融破壁：取预处理液，按质量体积比为1g:1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
甘薯蛋白多肽的制备方法，包括预处理、冻融破壁、蛋白酶共固定化、酶解、超滤纯化和冷冻干燥，其特征在于：所述的冻融破壁操作为：取预处理液，按质量体积比为1g:0.8~1.5ml加入超纯水，在‑30~‑12℃下冷冻40~70min，后在5~10℃下解冻，反复冻融1~5次，冻融结束后在8~16℃下离心，取上清液保存。

【技术特征摘要】
1.甘薯蛋白多肽的制备方法，包括预处理、冻融破壁、蛋白酶共固定化、酶解、超滤纯化和冷冻干燥，其特征在于：所述的冻融破壁操作为：取预处理液，按质量体积比为1g:0.8~1.5ml加入超纯水，在-30~-12℃下冷冻40~70min，后在5~10℃下解冻，反复冻融1~5次，冻融结束后在8~16℃下离心，取上清液保存。2.根据权利要求1所述的甘薯蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述的预处理操作为：取甘薯洗净去皮，粉碎后加入3~5倍体积超纯水浸提，浸提1~3次后合并浸提液，离心取上清液，得预处理液。3.根据权利要求1所述的甘薯蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述的蛋白酶共固定化操作为：取壳聚糖粉末，用磷酸盐缓冲液浸泡过夜，后经活化偶联，加入胰蛋白酶溶液和弹性蛋白酶溶液，于冰浴中缓慢搅拌0.7~1.9h，后冷藏18~27h，用蒸馏水彻底冲洗，过滤干燥得到壳聚糖固定化复...

【专利技术属性】
技术研发人员：全盈园，
申请(专利权)人：金华市铁骑士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33