一种鱿鱼活性多肽制造技术

本发明专利技术公开了一种鱿鱼活性多肽，活性多肽中支链氨基酸与芳香族氨基酸的物质的量比值为28‑32:1，其平均分子量为1.1‑3kDa。活性多肽的制备方法为：将鱿鱼蛋白粉用中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解，酶解过程中超滤，将超滤液中加入用改性活性炭脱色处理得到清滤液，清滤液经纳滤得浓缩多肽液，浓缩多肽液经凝胶柱层析和RP‑HPLC纯化得鱿鱼活性多肽。有益效果为：本发明专利技术鱿鱼活性多肽颜色较白，无苦味肽，感官接受度较高，具有较强的抗氧化活性，纯度和得率高；制备方法具有投入低、操作简单、蛋白质降解效果好、得率高的优势，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力。

An active polypeptide from squid

The invention discloses a squid active polypeptide, in which the ratio of branched chain amino acids to aromatic amino acids is 28_32:1 and the average molecular weight is 1.1_3 kDa. The preparation method of the active polypeptide is: enzymolysis of squid protein powder with neutral protease and flavor protease, ultrafiltration during enzymatic hydrolysis, adding ultrafiltration liquid to remove filtrate by modified activated carbon decolorization, filtrate filtrating and concentrating polypeptide solution through nanofiltration, and purifying the concentrated polypeptide liquid by gel column chromatography and RP HPLC to obtain squid activity. Peptide. The invention has the advantages of white color, no bitter peptide, high sensory acceptance, strong antioxidant activity, high purity and yield; the preparation method has the advantages of low input, simple operation, good protein degradation effect and high yield, and is easy to industrialize large-scale production, and has good application. Value and market potential.

【技术实现步骤摘要】
一种鱿鱼活性多肽
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种鱿鱼活性多肽。
技术介绍
鱿鱼，虽然习惯上称它们为鱼，其实它并不是鱼，而是生活在海洋中的软体动物。鱿鱼属于软体动物门，头足纲，枪乌贼科，通称枪乌贼。体色苍白，体圆锥形，头大，有淡褐色斑，前方生有10条触足，常成群游弋于深约20米的海洋中。常活动于浅海中上层，垂直移动范围达百余米。肉质细嫩，风味类似于鲍鱼，但价格很低，被成为“穷人的鲍鱼”。西方人因为鱿鱼表皮暗且易变，而称鱿鱼为“魔鬼鱼”；西班牙人吃鱿鱼比较多，他们把鱿鱼加工成不同风味的罐头，鱿鱼酱油，鱿鱼圈等；美国人近几年来也开始提倡吃鱿鱼，他们把鱿鱼加工成类似鲍鱼的形态出售；鱿鱼在日本很受欢迎，已成为日本日常生活中必不可少的水产品，日本人把鱿鱼一般加工成冷冻制品、干制品、珍味制品、盐渍制品、加热杀菌制品。鱿鱼加工中产生的副产物，如皮、内脏、眼及墨囊等，都作为废弃物丢掉，不仅造成了环境污染，也不能提高鱿鱼加工的附加值。鱿鱼全身都是宝，鱿鱼皮中含有大量的胶原蛋白，可用来提取胶原蛋白；内脏中含有促进草虾摄饵的氨基酸，粗脂肪（不饱和脂肪酸的含量很高），蛋白质（可用来生产鱿鱼酱油）；墨囊中的墨汁已被证实具有抗菌功能，还有抗肿瘤和增强免疫的功能。为了充分利用鱿鱼中的蛋白资源，许多科研工作者探索利用鱿鱼水解生成活性多肽。目前水解鱿鱼中的粗蛋白主要有两种方法：化学降解法和酶水解法。化学降解法是利用强酸强碱肽键来达到水解蛋白的目的，实验方法操作简单，但是反应剧烈不易控制，往往造成氨基酸的损坏。酶水解法反应条件温和，能很好的分离蛋白得到低分子多肽及氨基酸，所以得到广大科研工作者的青睐。现有的酶解技术都是侧重于控制底物浓度、温度、pH、酶的用量等初始反应条件，然而随着酶解反应的进行，底物浓度和pH都是变化的，导致胶原多肽酶解过程存在复杂、繁琐、难于控制的问题，因此现有技术对反应过程中这些条件的变化很难进行有效控制，同时对苦味肽的控制也是酶解反应后采取方法脱除，没有在反应过程中控制苦味肽的产生，这在一定程度上制约了鱿鱼的精深加工与应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种颜色较白，无苦味肽，感官接受度较高，具有较强的抗氧化活性，纯度和得率高的鱿鱼活性多肽。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种鱿鱼活性多肽，活性多肽中支链氨基酸与芳香族氨基酸的物质的量比值为28-32:1。较高的支链氨基酸与芳香族氨基酸的物质的量比值使得活性多肽具有较强的抗氧化活性，能有效将自由基从机体中清除，使生物大分子和生物膜等免受自由基的损害，还能有效抑制多酷氧化酶的活性，降低食物褐变的几率，使得该活性多肽能广泛应用于化妆品、保健食品、医药制品和饲料添加剂等领域。作为优选，活性多肽的平均分子量为1.1-3kDa。一种鱿鱼活性多肽的制备方法，包括酶解、脱色、纳滤、凝胶层析和RP-HPLC纯化，其具体步骤为：酶解步骤为：按底物浓度为2-5%向鱿鱼蛋白粉中加入去离子水，调节pH至6.5-8.0，按加酶量为6800-7000U/g和3500-4200U/g分别加入中性蛋白酶和风味蛋白酶，然后在温度为50-55℃下酶解2-4h，酶解间隔30-50min用截留分子量为3-5kDa的超滤膜超滤10-20min，即得超滤液，该该步骤采用中性蛋白酶和风味蛋白酶复合水解，能从不同的氨基酸位点进行酶切，从而产生大量的活性多肽，同时酶之间因具有协同增效作用而导致加强效应，相应产生的多肽片段功能会进一步增强，最终提高鱿鱼蛋白的酶解效率、酶解液中多肽的含量和活性多肽的活性；而在反应过程中用超滤除去小分子产物，避免了继续作为底物被酶解成小分子产物，而小分子产物是苦味肽的来源，这样进一步减少了苦味肽的生成，从而减少了产物的损失，且能够降低酶解体系中产物的浓度，使得酶解反应速率能够继续保持，大大缩短酶解时间，该步骤中多肽的得率为38.42%；脱色：将超滤液加热至50-70℃，调节pH为5.5-6.5，加入用乙酸乙酯与氧氧化钠改性的改性活性炭，添加量为鱿鱼蛋白重量的0.8-1.5%，超声波搅拌20-40min，过滤，得到清滤液，该步骤改性活性炭的吸附性能佳，在超滤液能够分散均匀，在用量少、时间短的条件下即能达到良好的脱色脱腥效果，且有效成分不损失，能使得活性多肽较白，感官接受度较高；纳滤：将清滤液经0.8-1kDa的纳滤膜纳滤，获得0.8-1kDa以上的浓缩多肽液，备用；凝胶柱层析：将浓缩多肽液溶于双蒸水配成浓度为45-55mg/mL的溶液，在2-5℃、10000-15000r/min下离心15-23min，去除不溶性杂质，上清液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶柱层析酶解物，该方法根据酶解液在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便，且不需要抗氧化肽与其他物质结合，减少了纯化过程中抗氧化肽的损失，不影响目标组分化学性质，能保持抗氧化肽原有的活性不受破坏；RP-HPLC纯化步骤为：将凝胶柱层析酶解物用双蒸水配成溶液，利用高效液相色谱进行分离，流动相为乙腈和酒石酸水溶液，将属于同一峰的收集液混合，除去乙腈和三氟乙酸，冻干，即得活性多肽，上述色谱条件为：溶液的浓度为80-100μg/mL、进样量为4-6μL、色谱柱为AgilentC18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25-35℃、洗脱速度为0.8-1.2mL/min，该方法具有分析速度快、分辨率高、灵敏度高、分离效果好的优势，能快速分离纯化目标物质，可提高活性多肽的抗氧化活性，同时该纯化步骤所需样品量少，进样量以µL为数量级，可同时分离多种成分，能反复进样，且分离过程中样品不被破坏，易回收，获得的组分纯度较高。作为优选，脱色用乙酸乙酯中含有0.33-0.38wt%的柠檬黄和1.8-2.4wt%的苯甲酸钠。柠檬黄和苯甲酸钠的加入有利于加快乙酸乙酯与氧氧化钠的水解反应及亲水性有机盐分子的移动，使得亲水性有机盐分子在活性炭内部的分布也更加广泛与均匀，有更多的色素和腥味物质在改性活性炭内部与亲水性表面基团以氧键形式结合；同时能提高活性炭表面的酸性含氧官能团，而这些官能团能与色素发生络合作用，增加了对色素的吸附量，最终经改性活性炭处理能使得活性多肽较白，感官接受度较高。作为优选，脱色用改性活性炭为亲水性活性炭，其制备方法为：按料液比为1:8-12g/mL将活性炭放入浓度为0.8-1.2M的氧氧化钠溶液中浸泡45-50h，然后用去离子水快速洗涤2-3次，再将活性炭放入乙酸乙酯中，在75-85℃下搅拌45-50h，干燥，即得改性活性炭。该步骤通过乙酸乙酯与氧氧化钠在活性炭表面发生水解反应，然后将亲水性分子乙酸钠引入到活性炭表面，内部结构主要以微孔为主，使得改性活性炭在超滤液能够分散均匀，提高改性活性炭和超滤液的接触，从而快速吸附色素和腥味物质，同时促使空间结构向无序化的“乱层结构”转化，扩大活性炭的孔隙，改善孔径比例，进一步提高活性炭的吸附性能，使得活性多肽较白。作为优选，RP-HPLC纯化步骤中酒石酸水溶液浓度为0.08-0.12%，所述乙腈和酒石酸水溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鱿鱼活性多肽，其特征在于：所述活性多肽中支链氨基酸与芳香族氨基酸的物质的量比值为28‑32:1。

【技术特征摘要】
1.一种鱿鱼活性多肽，其特征在于：所述活性多肽中支链氨基酸与芳香族氨基酸的物质的量比值为28-32:1。2.根据权利要求1所述的一种鱿鱼活性多肽，其特征在于：所述活性多肽的平均分子量为1.1-3kDa。3.一种鱿鱼活性多肽的制备方法，包括酶解、脱色、纳滤、凝胶层析和RP-HPLC纯化，其特征在于：所述脱色步骤为：将超滤液中加入用乙酸乙酯与氧氧化钠改性的改性活性炭，超声波搅拌，过滤，得到清滤液。4.根据权利要求3所述的一种鱿鱼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述脱色条件为：温度为50-70℃，pH为5.5-6.5，改性活性炭的添加量为鱿鱼蛋白粉重量的0.8-1.5%，时间为20-40min。5.根据权利要求3所述的一种鱿鱼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述乙酸乙酯中含有0.33-0.38wt%的柠檬黄和1.8-2.4wt%的苯甲酸钠。6.根据权利要求3所述的一种鱿鱼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述改性活性炭为亲水性活性炭，其制备方法为：按料液比为1:8-12g/mL将活性炭放入浓度为0.8-1.2M的氧氧化钠溶液中浸泡45-...

【专利技术属性】
技术研发人员：全盈园，
申请(专利权)人：金华市铁骑士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33