利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，具体包括：以地黄属植物茎为外植体，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系；然后于生物反应器中加入联合诱导子β‑CD和茉莉酸甲酯进行悬浮培养，之后经超声提取、大孔树脂吸附、高效液相制备柱进行精制后得到高纯度的梓醇。本发明专利技术利用的植物干细胞培养体系具有同步生长、遗传性状稳定、生长速度快、梓醇合成稳定等优良特性，其作为制备梓醇的原料，为梓醇的制备提供了一种新方法；此外，与化学合成相比，本发明专利技术利用生物反应器培养技术结合植物干细胞培养技术生产高纯度梓醇，具有生产周期短，安全性高，成本低，产量高，低污染等优点。

Production of Catalpol from stem cells of Rehmannia glutinosa stem by suspension culture

The invention discloses a method of producing Catalpol by using the stem cells of the stem of Rehmannia glutinosa in suspension culture, which includes: using the stem of the genus Rehmannia plant as explant, through induction culture, separation and culture and subculture to establish a stable growing Rehmannia formation stem cell culture system, and then join together in the bioreactor. After suspension culture of beta CD and methyl jasmonate, the high purity Catalpol was obtained by ultrasonic extraction, macroporous resin adsorption and high performance liquid phase preparation. The plant stem cell culture system has excellent characteristics such as synchronous growth, stable genetic character, fast growth speed and synthesis of Catalpol. As the raw material for preparing Catalpol, it provides a new method for the preparation of Catalpol. In addition, compared with chemical synthesis, the invention uses bioreactor culture technology. Combined with plant stem cell culture technology, producing high purity Catalpol has the advantages of short production cycle, high safety, low cost, high yield and low pollution.

【技术实现步骤摘要】
利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法
本专利技术属于医药生物工程
，特别涉及一种利用悬浮培养的地黄属植物茎形成层干细胞生产梓醇的方法。
技术介绍
地黄是我国最著名的中药材之一，据统计，约有80多种中成药以生地黄为主要原料，如六味地黄丸、知柏地黄丸、乌鸡白凤丸、消糖丸等。梓醇是地黄中主要活性成分之一，具有广泛的药理活性，如降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、神经保护等。2017年1月25日，青海央宗药业有限公司自主研发的“梓醇片”取得国家食品药品监督管理局中药一类药物临床试验批件。地黄生长周期较长，且易受生长环境的影响，连续种植的地黄，地下根茎多为须根，无法形成膨大的具备要用价值的块茎，只能间隔8-10年后才能种植。连作障碍已经成为制约地黄种植生产亟待解决的难题。河南焦作是怀地黄的道地产区，随着种植面积的不断增加，较多地区出现无新地可供种植，轮作年限严重缩短的情况，严重制约了地黄的产量及质量。此外，地黄植物中梓醇含量较低(1吨干重的熟地黄中仅能提取得到2g的梓醇)，化学组分复杂，提取分离纯化的成本较高。19世纪30年代，科学家首次建立了离体培养植物细胞的培养技术。经过80年的发展，植物生物技术得到了长足的发展，利用植物细胞培养技术生产重要活性次生代谢产物得到越来越多科学家的关注，并已有一些成功实现工业化生产的案例，如利用生物反应器技术悬浮培养红豆杉脱分化细胞可工业化生产紫杉醇，利用悬浮培养的黄连脱分化细胞可工业化生产小檗碱，利用悬浮培养的彩叶草脱分化细胞可工业化生产迷迭香酸等。当前所使用的植物细胞培养技术多以离体的茎、根、叶等为细胞来源，这种方式获得的细胞均为脱分化细胞。在离体细胞的获得过程中，细胞易发生有害的表观遗传变异和基因变异或缺失，经过长期培养后细胞生长变慢，次生代谢产物的种类和含量逐渐下降。因此，建立遗传信息稳定，经长期培养后仍然保持较高的生长速率和较高产量次生代谢产物的细胞培养体系是植物细胞培养亟待解决的首要问题。植物干细胞是一种原始的、未分化的，具有全能性或多能性的细胞，它可以分化成多种细胞类型或组织器官。植物干细胞为根、茎和叶等器官的形成及再生源源不断的提供新细胞，并贯穿植物的整个生命周期。植物干细胞存在于植物的茎顶端分生组织、根尖分生组织和维管形成层。植物维管束形成层为干细胞提供小生境，并维持多能干细胞的数量和功能。2010年，韩国云火科学院的科学家从野生的红豆杉枝条中分离培养了红豆杉形成层分生组织细胞，经稳定化培养后获得红豆杉干细胞培养体系，其紫杉醇含量高达264mg/kg，并可实现3吨规模的工业化生产。利用现有的植物细胞培养技术获得的地黄脱分化细胞梓醇含量较低，且不能长期稳定的用于工业化生产活性次生代谢产物。
技术实现思路
为解决目前地黄脱分化细胞梓醇含量较低的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞长期稳定生产梓醇的方法，该方法具有生产周期短、环境友好、可持续性强、产量高且稳定等特点。本专利技术提供的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，具体包括如下步骤：S1：以地黄属植物茎为外植体，对外植体进行灭菌，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄茎形成层干细胞培养体系；S2：将地黄形成层干细胞培养体系于生物反应器中进行悬浮培养，向悬浮培养基中加入联合诱导子β-CD和茉莉酸甲酯刺激梓醇的累积；S3：收集经S2悬浮培养的培养物，并进行冷冻干燥，得到冻干粉，采用70～95％的乙醇溶液对所述冻干粉进行超声提取数次，过滤并合并提取液后于低温减压浓缩得浸膏I；S4：将S3所得浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，对粗提液进行大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并提取液后低温减压浓缩得浸膏II；S5：采用高效液相制备柱对S4所得浸膏II进行精制得到高纯度的梓醇。优选地，所述地黄属植物包括天目地黄RehmanniachingiiLi、高地黄RehmanniaelataN.E.Brown、地黄Rehmanniaglutinosa(Gaetn.)Libosch.exFisch.etMey.、湖北地黄RehmanniahenryiN.E.Brown、裂叶地黄RehmanniapiasezkiiMaxim、茄叶地黄RehmanniasolanifoliaTsoongetChin。优选地，S1中，所述稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系是通过如下方法建立得到的：1)取新鲜采摘的野生地黄茎部，清洗后切成含有维管束的木质部、韧皮部和形成层的小块作为外植体；2)使用灭菌水对步骤1)处理后的外植体进行灭菌冲洗，再使用至少一种灭菌剂进行灭菌处理后，杀死外植体表面和内部的内生真菌，然后用无菌水冲洗3～5次，获得表面无菌的外植体；3)将经步骤2)灭菌处理后的外植体置于诱导培养基中培养5～15天，维管束形成层干细胞和脱分化细胞快速分裂生长，形成明显的细胞团后置于分离培养基中培养3～12天，直至维管束形成层干细胞从外植体中剥离开，与脱分化细胞相互发生分层现象；所述诱导培养基的配方为：添加有10～20g/L蔗糖、1.5～4.5g/L结冷胶和1.5～3.5mg/L生长素的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.5～6.0；所述生长素选自6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸中的一种；所述分离培养基的配方为：添加有10～25g/L蔗糖、1.0～4.0g/L结冷胶、1.0～3.0mg/L生长素的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.0～6.0；所述生长素选自6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸中的一种；4)将步骤3)中发生分层的细胞转移至继代培养基中培养10～20天，然后再转移至新鲜的生长培养基中10～20天，如此重复连续继代培养后获得能稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系；所述继代培养基的配方为：添加有10～25g/L蔗糖、1.0～4.0g/L结冷胶、0.4～0.8g/L活性炭、0.5～3.0mg/LNAA和0.5～3.0mg/L6-BA的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.0～6.0。更优选地，上述步骤3)中的诱导培养和分离培养，以及步骤4)中的继代培养的培养条件均为：温度22～28℃，湿度60～80％，光照来源为LED白光灯，光照强度2200～3200lx，光照时间为12～16h。优选地，S2中，将所述地黄形成层干细胞培养体系在悬浮培养基中进行悬浮培养，接种量为45～65g/L；悬浮培养条件为：温度为20～26℃，转速100～140rpm，溶氧量0.2～0.45mg/L，通气比0.35～0.55vvm，光照来源为LED白光灯，光照强度2200～3200lx，光照时间为10～18h，pH值为5.5～5.9，连续培养10～24天；所述悬浮培养基为添加有15～35g/L蔗糖、0.5～2.5mg/L生长素的MS液体培养基，所述生长素选自6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸中的一种。更优选地，S2中，所述β-CD的添加浓度为60～160mmol/L，所述茉莉酸甲酯的添加浓度为50～160μmol/L。优选地，S3中，对所述冻干粉进行超声提取时，单次超声提取温度为20～30℃，提取时间为30～60min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术通过以地黄属植物茎本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1：以地黄属植物茎为外植体，对外植体进行灭菌，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄茎形成层干细胞培养体系；S2：将地黄形成层干细胞培养体系于生物反应器中进行悬浮培养，向悬浮培养基中加入联合诱导子β‑CD和茉莉酸甲酯刺激梓醇的累积；S3：收集经S2悬浮培养的培养物，进行冷冻干燥，得到冻干粉，采用70～95％的乙醇溶液对所述冻干粉进行超声提取数次，过滤并合并提取液后于低温减压浓缩得浸膏I；S4：将S3所得浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，对粗提液进行大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浸膏II；S5：采用高效液相制备柱对S4所得浸膏II进行精制得到高纯度的梓醇。

【技术特征摘要】
1.一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1：以地黄属植物茎为外植体，对外植体进行灭菌，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄茎形成层干细胞培养体系；S2：将地黄形成层干细胞培养体系于生物反应器中进行悬浮培养，向悬浮培养基中加入联合诱导子β-CD和茉莉酸甲酯刺激梓醇的累积；S3：收集经S2悬浮培养的培养物，进行冷冻干燥，得到冻干粉，采用70～95％的乙醇溶液对所述冻干粉进行超声提取数次，过滤并合并提取液后于低温减压浓缩得浸膏I；S4：将S3所得浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，对粗提液进行大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浸膏II；S5：采用高效液相制备柱对S4所得浸膏II进行精制得到高纯度的梓醇。2.根据权利要求1所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，所述地黄属植物包括天目地黄RehmanniachingiiLi、高地黄RehmanniaelataN.E.Brown、地黄Rehmanniaglutinosa(Gaetn.)Libosch.exFisch.etMey.、湖北地黄RehmanniahenryiN.E.Brown、裂叶地黄RehmanniapiasezkiiMaxim、茄叶地黄RehmanniasolanifoliaTsoongetChin。3.根据权利要求1所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，S1中，所述稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系是通过如下方法建立得到的：1)取新鲜采摘的野生地黄茎部，清洗后切成含有维管束的木质部、韧皮部和形成层的小块作为外植体；2)使用灭菌水对步骤1)处理后的外植体进行灭菌冲洗，再使用至少一种灭菌剂进行灭菌处理后，杀死外植体表面和内部的内生真菌，然后用无菌水冲洗3～5次，获得表面无菌的外植体；3)将经步骤2)灭菌处理后的外植体置于诱导培养基中诱导培养5～15天，维管束形成层干细胞和脱分化细胞快速分裂生长，形成明显的细胞团后置于分离培养基中培养3～12天，直至维管束形成层干细胞从外植体中剥离开，与脱分化细胞相互发生分层现象；所述诱导培养基的配方为：添加有10～20g/L蔗糖、1.5～4.5g/L结冷胶和1.5～3.5mg/L生长素...

【专利技术属性】
技术研发人员：周鹏飞，刘友才，张伟，李海华，闫思涵，谢永生，张毅敏，史世强，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41