同时检测氨基酸、肉碱、酮类、激素的方法和试剂盒技术

本申请公开了一种同时检测氨基酸、肉碱、酮类、激素的方法和试剂盒。本申请的方法，包括用提取工作液对待测血斑样本进行孵育；离心，取上清液，采用串联质谱对进行检测，获得氨基酸、肉碱、酮类、激素信息；提取工作液包括氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、17α羟孕酮同位素内标准品、琥珀酰丙酮内标准品和有机溶剂。本申请的方法，只需要一次采血就可以实现氨基酸、肉碱、酮类、激素四大类物质的同时检测，节省了人力成本，也避免了多次采血对待测人员的身心影响。本申请的方法，一次性定量检测13种氨基酸、32种肉碱、1种激素和1种酮类，根据这些指标能筛查46种遗传性代谢疾病，提升了对新生儿遗传代谢性疾病的筛查效率。

【技术实现步骤摘要】
同时检测氨基酸、肉碱、酮类、激素的方法和试剂盒
本申请涉及遗传代谢疾病相关物质检测领域，特别是涉及一种同时检测氨基酸、肉碱、酮类、激素的方法和试剂盒。
技术介绍
遗传性代谢疾病是由于遗传物质变异导致代谢功能障碍，从而引发一系列的临床症状的疾病，涉及氨基酸、肉碱、维生素、类固醇等多种物质代谢。据统计，每年我国遗传代谢性疾病新生儿达40-50万，对遗传性代谢疾病及早的发现并进行干预和治疗，可避免和减轻疾病给患儿及其家庭带来的伤害和影响。现有应用的新生儿代谢性疾病筛查技术有细菌抑制法、酶联免疫法、荧光法等，但这些方法一次只能筛查一种疾病。串联质谱(MS/MS)通过对母离子和子离子的双重选择，大大提升了检测的特异性、灵敏度，从而实现在1-2min内对同一个样本的多种代谢物进行同时检测，可以对氨基酸代谢障碍性疾病，脂肪酸代谢障碍性疾病，有机酸代谢障碍性疾病，激素代谢障碍性疾病等多种类型的遗传代谢病疾病进行筛查。目前，国际上有美国PerkinElmer公司开发的“非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒(串联质谱法)”；国内有广州丰华生物工程有限公司开发的“非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒(串联质谱法)”和“衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒(串联质谱法)”。无论是国际还是国内的测定试剂盒，都存在如下不足：A、只能一次性检测部分氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮，而激素类的检测指标需要单独采样，单独检测；B、新生儿筛查衍生化路线需使用酰氯，会对环境造成污染；C、在检测氨基酸和肉碱相关的疾病、先天性肾上腺皮质增生症的时候，需要待检者采血两次，有可能造成多一次的心理阴影。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种改进的同时检测氨基酸、肉碱、酮类、激素的方法和试剂盒。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种同时检测氨基酸、肉碱、酮类、激素的方法，包括采用提取工作液对待测血斑样本进行孵育；离心，取上清液，采用串联质谱对上清液进行检测，获得待测血斑样本中的氨基酸、肉碱、酮类、激素信息；提取工作液包括氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、17α羟孕酮同位素内标准品、琥珀酰丙酮内标准品和有机溶剂。需要说明的是，本申请的检测方法，通过对提取工作液进行改进，具体的，在提取工作液中添加氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、17α羟孕酮同位素内标准品、琥珀酰丙酮内标准品，并采用串联质谱，可以实现氨基酸、肉碱、酮类、激素四大类物质的同时检测。本申请的方法，只需要一次采血就可以完成氨基酸代谢障碍性疾病、肉碱代谢障碍性疾病和激素代谢障碍性疾病等多种类的多项疾病的筛查，一方面缩减了检测工作步骤和时间，提高了检测效率，另一方面，也避免了多次采血对待测人员造成的痛苦或心理阴影。本申请的一种实现方式中，通过串联质谱检测，在检测干血斑样本时，仅需约3微升血液样本就可以一次性定量检测13种氨基酸、32种肉碱、1种激素和1种酮类，根据这些指标能筛查46种遗传性代谢疾病，大大提升了对新生儿遗传代谢性疾病的筛查效率。还需要说明的是，本申请的提取工作液中，氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、17α羟孕酮同位素内标准品、琥珀酰丙酮内标准品可以采用市售的各种同位素标准品，例如美国剑桥实验室提供的氨基酸、肉碱、琥珀酰丙酮同位素标准品，美国CIL公司提供的17α羟孕酮同位素标准品等，在此不做具体限定。在本申请的优选方案中，对氨基酸同位素内标准品和肉碱同位素内标准品进行了限定，详见以下方案。优选的，孵育的条件为，30℃、700～750rpm条件下振荡30分钟。优选的，氨基酸同位素内标准品包括L-d4-丙氨酸、L-d8-缬氨酸、L-d3-亮氨酸、L-d3-甲硫氨酸、L-13C6-苯丙氨酸、L-13C6-酪氨酸、L-d2-瓜氨酸、L-d2-鸟氨酸和L-d4；5-13C-精氨酸中的至少一种。需要说明的是，本申请的一种实现方式中，采用L-d4-丙氨酸、L-d8-缬氨酸、L-d3-亮氨酸、L-d3-甲硫氨酸、L-13C6-苯丙氨酸、L-13C6-酪氨酸、L-d2-瓜氨酸、L-d2-鸟氨酸和L-d4；5-13C-精氨酸，九种氨基酸同位素内标准品，按照本申请的半定量方法，通过结构近似的内标定量分析物，可以对13种氨基酸进行检测。优选的，肉碱同位素内标准品包括L-d9-游离肉碱、L-d3-乙酰肉碱、L-d3-丙酰肉碱、L-d3-丁酰肉碱、L-d9-异戊酰肉碱、L-d3-辛酰肉碱、L-d9-肉豆蔻酰肉碱和L-d3-棕榈酰肉碱中的至少一种。需要说明的是，本申请的一种实现方式中，采用L-d9-游离肉碱、L-d3-乙酰肉碱、L-d3-丙酰肉碱、L-d3-丁酰肉碱、L-d9-异戊酰肉碱、L-d3-辛酰肉碱、L-d9-肉豆蔻酰肉碱和L-d3-棕榈酰肉碱，八种肉碱同位素内标准品，按照本申请的半定量方法，通过结构近似的内标定量分析物，可以对32种肉碱进行检测。优选的，提取工作液中，有机溶剂为甲醇。本申请的另一面公开了一种同时检测氨基酸、肉碱、酮类、激素的试剂盒，该试剂盒用于采用串联质谱对待测血斑样本进行质谱检测，试剂盒包括独立包装的以下组分，(A)氨基酸同位素内标准品；(B)肉碱同位素内标准品；(C)17α羟孕酮同位素内标准品；(D)琥珀酰丙酮处理液，琥珀酰丙酮处理液中含有琥珀酰丙酮内标准品和水合肼溶液；(E)质控品，质控品为含有氨基酸和肉碱的人全血滤纸干血片。需要说明的是，其中，质控品用于评估仪器是否波动，即检测质控品中各个分析物浓度的波动范围，本申请的一种实现方式中，用变异系数CV表示，CV＝标准偏差/均值，通过质控品的多次检测结果，分析各个分析物的CV值，当CV≤25％时，表示仪器状态良好，采集数据良好。优选的，本申请的试剂盒中，氨基酸同位素内标准品包括L-d4-丙氨酸、L-d8-缬氨酸、L-d3-亮氨酸、L-d3-甲硫氨酸、L-13C6-苯丙氨酸、L-13C6-酪氨酸、L-d2-瓜氨酸、L-d2-鸟氨酸和L-d4；5-13C-精氨酸中的至少一种。优选的，本申请的试剂盒中，肉碱同位素内标准品包括L-d9-游离肉碱、L-d3-乙酰肉碱、L-d3-丙酰肉碱、L-d3-丁酰肉碱、L-d9-异戊酰肉碱、L-d3-辛酰肉碱、L-d9-肉豆蔻酰肉碱和L-d3-棕榈酰肉碱中的至少一种。优选的，本申请的试剂盒中还包括V型底96孔板、铝箔封口膜和使用说明书中的至少一种。需要说明的是，V型底96孔板和铝箔封口膜可以选择性的加入试剂盒中，以方便使用，也可以单独另行购置，在此不做具体限定。使用说明书实际上就是按照本申请的方法和实施例中记载的内容所编写的试验操作步骤。本申请的再一面公开了本申请的试剂盒，在制备遗传性代谢疾病检测药物或装置中的应用；其中，遗传性代谢疾病包括氨基酸代谢障碍性疾病、肉碱代谢障碍性疾病和激素代谢障碍性疾病中的至少一种。优选的，本申请的一种实现方式中，尤其可以在检测氨基酸和肉碱相关疾病的同时检测先天性肾上腺皮质增生症。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：本申请的检测方法，可以实现氨基酸、肉碱、酮类、激素四大类物质的同时检测，避免了衍生化路线对环境的污染，并且，在检测氨基酸和肉碱相关疾病的同时，可以对先天性肾上腺皮质增生症进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测氨基酸、肉碱、酮类、激素的方法，其特征在于：包括采用提取工作液对待测血斑样本进行孵育；离心，取上清液，采用串联质谱对所述上清液进行检测，获得待测血斑样本中的氨基酸、肉碱、酮类、激素信息；所述提取工作液包括氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、17α羟孕酮同位素内标准品、琥珀酰丙酮内标准品和有机溶剂。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测氨基酸、肉碱、酮类、激素的方法，其特征在于：包括采用提取工作液对待测血斑样本进行孵育；离心，取上清液，采用串联质谱对所述上清液进行检测，获得待测血斑样本中的氨基酸、肉碱、酮类、激素信息；所述提取工作液包括氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、17α羟孕酮同位素内标准品、琥珀酰丙酮内标准品和有机溶剂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述孵育的条件为，30℃、700～750rpm条件下振荡30分钟。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述氨基酸同位素内标准品包括L-d4-丙氨酸、L-d8-缬氨酸、L-d3-亮氨酸、L-d3-甲硫氨酸、L-13C6-苯丙氨酸、L-13C6-酪氨酸、L-d2-瓜氨酸、L-d2-鸟氨酸和L-d4；5-13C-精氨酸中的至少一种。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述肉碱同位素内标准品包括L-d9-游离肉碱、L-d3-乙酰肉碱、L-d3-丙酰肉碱、L-d3-丁酰肉碱、L-d9-异戊酰肉碱、L-d3-辛酰肉碱、L-d9-肉豆蔻酰肉碱和L-d3-棕榈酰肉碱中的至少一种。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述提取工作液中，有机溶剂为甲醇。6.一种同时检测氨基酸、肉碱、酮类、激素的试剂盒，所述试剂盒用于采用串联质谱对待测血斑样本进行质谱检测，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓敏，王远，张秋韵，卢鹏飞，高新彦，饶维桥，林梁，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44