包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸的化合物和组合物及其使用方法技术

本公开涉及一种包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列缀合于短活化RNA(saRNA)或反义寡核苷酸序列(ASO)的经分离化合物、这种化合物的组合物、以及通过一种所公开化合物或组合物来达成的治疗癌症和自体免疫疾病(伴有或不伴有刺激免疫应答)的方法、免疫刺激方法、使CEBPA活化的方法和使STAT转录因子的活性降低的方法。

Compounds and compositions comprising thiophosphorylated oligodeoxynucleotides and methods of use thereof

The present disclosure relates to a separation compound, a compound, a compound, a compound, a compound, a compound, a compound, and a treatment of cancer and autologous immune disease (accompanied by or not accompanied by a ODN) of a sequence of oligodeoxynucleotides (saRNA) or a sequence of antisense oligonucleotides (ASO). Methods for stimulating immune response, immunostimulatory methods, methods for activating CEBPA and methods for reducing the activity of STAT transcription factors.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸的化合物和组合物及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年7月2日提交的美国临时申请号：62/187,878和2015年12月7日提交的美国临时申请号：62/264,026的权益，所述美国临时申请各自的内容据此以整体方式以及出于所有目的并入本文。以ASCII文本文件形式提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录的引用写入文件48440-570001WO_ST25.TXT(2016年6月14日创建，73,469字节，机器格式IBM-PC，MS-Windows操作系统)中的序列表据此以引用的方式并入本文。公开背景急性骨髓性白血病的特征在于不成熟的骨髓性祖细胞的积累。白血病发生由控制骨髓性谱系分化、自我更新和/或增殖的致癌基因、肿瘤抑制子或转录因子的去调控所致。转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)促进粒细胞和巨噬细胞的分化，并且负性调控造血干细胞自我更新。在应急粒细胞生成期间以及在白血病发生期间，C/EBPα被C/EBPβ和STAT3转录因子的转录活性取代。C/EBPα的突变或下调常常在患有AML的患者中观察到。短活化RNA(saRNA)能够诱导基因表达。saRNA和其它寡核苷酸治疗剂的临床应用中的一个因素是难以达成它们的靶向递送，另外，免疫系统对核酸的固有敏感性使临床应用复杂化。STAT3在癌细胞与非恶性肿瘤相关细胞两者中均起作用。然而，靶向诸如STAT3的转录因子由于它们缺乏酶活性而复杂，并且需要非药理学方法。用于抑制STAT3的反义技术具有有限作用，因为可用的反义寡核苷酸缺乏细胞选择性。本公开涉及用针对散播性癌症的稳定和适于全身性施用的saRNA缀合硫代磷酸化寡核苷酸治疗例如AML的癌症的化合物、组合物和方法。本公开也涉及用缀合于硫代磷酸化寡核苷酸的反义寡核苷酸治疗例如前列腺癌和胶质母细胞瘤的癌症的化合物、组合物和方法。公开简述在一个方面，本公开尤其提供一种用于调节靶标基因的表达的经分离化合物，其包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)缀合于寡核苷酸。在一个方面，本公开包括一种经分离化合物，其包括硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)缀合于目标基因的反义核酸序列或短活化RNA(saRNA)。在各实施方案中，ODN是长度为15至30个碱基的单链部分或完全硫代磷酸化寡脱氧核苷酸。在各实施方案中，本公开的化合物包括用于增强基因表达的短活化RNA(saRNA)或用于抑制基因表达的反义序列。在一个方面，本公开包括一种用化合物或包括化合物的组合物治疗受试者的癌症，伴有或不伴有用本公开的化合物或包括化合物的组合物刺激受试者中的免疫应答的方法。在一个方面，本公开包括一种用本公开的化合物或包括化合物的组合物增强细胞中的C/EBPα表达的方法，所述化合物包括C/EBPα的saRNA缀合于硫代磷酸化寡核苷酸。在一个方面，本公开包括一种用本公开的化合物或包括化合物的组合物抑制转录因子信号转导子和转录活化子(STAT)(STAT1–STAT6)的表达的方法，所述化合物包括STAT1–STAT6中的一者或多者的反义寡核苷酸(ASO)缀合于硫代磷酸化寡核苷酸。在一个方面，本公开包括一种通过使细胞与有效量的化合物或包括化合物的组合物接触来抑制细胞生长的方法。短活化RNA(saRNA)能够活化CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)。方法包括治疗骨髓瘤、急性骨髓性白血病、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、头颈部癌、食道癌、皮肤癌、黑素瘤、脑癌、结肠直肠癌、白血病或淋巴瘤。组合物可通过静脉内、胃肠外、皮下、肌肉内、经皮、腹膜内、鼻内、气雾剂、口服或局部施用来向受试者施用。本公开的其它特征和优势将根据以下详细描述和权利要求而显而易知。除非相反指示，否则本文中的所有出版物、参考文献、专利和/或专利申请参考文献都据此出于所有目的以引用的方式整体并入本文。附图简述图1A-1F显示化学稳定化CpG-CEBPAsaRNA寡核苷酸的设计。显示双链和单链CpG-CEBPAsaRNA缀合物的序列。加下划线的是缀合物骨架中的硫代磷酸化位点；2’OMe修饰的核苷酸显示在矩形框内部并用斜体表示；指示包括C3接头的5个单元的接头(GlenResearch)的位置；AS＝反义链；SS＝有义链。图1A描绘包含SEQIDNO:103和双链体链SEQIDNO:2的缀合物序列。图1B描绘包含SEQIDNO:104和双链体链SEQIDNO:105的缀合物序列。图1C描绘包含SEQIDNO:103的缀合物序列。图1D描绘包含SEQIDNO:104的缀合物序列。图1E描绘包含SEQIDNO:106和双链体链SEQIDNO:107的缀合物序列。图1F描绘包含SEQIDNO:108和双链体链SEQIDNO:109的缀合物序列。图2A和2B是通过实时定量PCR(qPCR)测量的mRNA表达水平的柱状图。图2C和2D是蛋白质表达水平的蛋白质印迹图像。在500nM的各种CpG-saRNA缀合物存在下孵育从野生型(WT)或TLR9缺陷性(TLR9KO)小鼠分离的新鲜骨髓细胞，或使用Lipofectamine2000，用50nM的未缀合saRNA转染。分别使用qPCR(图2A-2B)和蛋白质印迹(图2C-2D)测量C/EBPα的mRNA和蛋白质水平。图3显示柱状图，其显示CpG-CEBPAsaRNA触发靶标人癌细胞中C/EBPα的转录活性。在500nM的各种CpG-saRNA缀合物存在下孵育表达C/EBPα特异性启动子-荧光素酶构建体的人DU145前列腺癌细胞，或如所指示使用Lipofectamine2000，用50nM的未缀合saRNA转染；具有匹配萤火虫荧光素酶的序列的CpG-FLUC-RNA缀合物用作阴性对照。72小时后，使细胞溶解，并且使用CignalC/EBP报道体测定试剂盒(Qiagen)分析水平。图4A和4B分别显示人DU145前列腺癌细胞和MOLM13白血病细胞在以下测定的情况下的柱状图，所述测定用以显示CpG-CEBPAsaRNA对人细胞和小鼠细胞中的C/EBPαmRNA和蛋白质水平的TLR9依赖性影响。在500nM的各种CpG-saRNA缀合物存在下孵育人DU145前列腺癌细胞(图4A)和MOLM13白血病细胞(图4B)，或使用Lipofectamine2000，用50nM的未缀合saRNA转染；具有匹配萤火虫荧光素酶的序列的CpG-FLUC-RNA缀合物用作阴性对照。72小时后，使细胞溶解以获得经分离RNA来使用实时定量PCR(qPCR)分析CEBPAmRNA水平。图5A-5C是在体外持续48小时与500nMCpG-CEBPAsaRNA一起孵育或用单独CEBPsaRNA转染的人MV4-11AML细胞的流式细胞术图谱。使用流式细胞术评估HLADR和共刺激分子CD86和CD40的表达。数据显示(CD86(图5A)、CD40(图5B)和HLADR(图5C))CpG-CEBPAsaRNA在体内具有免疫刺激作用。图6A-6B显示CpG-CEBPAsaRNA对小鼠中同基因白血病细胞的剂量依赖性影响的线形图和流式细胞术数据。在建立Cbfb/MYH11/Mpl白血病(血液中的AML细胞>1％，在1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经分离化合物，其包含硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列缀合于：(i)CCAAT/增强子结合蛋白‑α(C/EBPα)的短活化RNA(saRNA)，或(ii)信号转导子和转录活化子(STAT)的反义寡核苷酸(ASO)序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.02 US 62/187,878;2015.12.07 US 62/264,0261.一种经分离化合物，其包含硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)序列缀合于：(i)CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)的短活化RNA(saRNA)，或(ii)信号转导子和转录活化子(STAT)的反义寡核苷酸(ASO)序列。2.如权利要求1所述的化合物，其中所述反义寡核苷酸序列是抗STAT1寡核苷酸序列、抗STAT2寡核苷酸序列、抗STAT3寡核苷酸序列、抗STAT4寡核苷酸序列、抗STAT5A寡核苷酸序列、抗STAT5B寡核苷酸序列或抗STAT6寡核苷酸序列。3.如权利要求1所述的化合物，其进一步在所述硫代磷酸化ODN序列与所述短活化RNA(saRNA)或所述ASO之间包含接头。4.如权利要求3所述的化合物，其中所述接头是取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的亚杂烷基。5.如权利要求3所述的化合物，其中所述接头是取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。6.如权利要求3所述的化合物，其中所述接头是取代或未取代的C1-C40亚烷基、取代或未取代的2至40元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3至8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或取代或未取代的5至10元亚杂芳基。7.如权利要求3所述的化合物，其中所述接头是未取代的C1-C40亚烷基、未取代的2至40元亚杂烷基、未取代的C3-C8亚环烷基、未取代的3至8元亚杂环烷基、未取代的C6-C10亚芳基或未取代的5至10元亚杂芳基。8.如权利要求3所述的化合物，其中所述接头是取代的2至40元亚杂烷基。9.如权利要求1所述的化合物，其中所述saRNA或所述ASO包含选自由以下组成的组的化学修饰：2’O-甲基、2’-脱氧-2’氟、2’-脱氧、通用碱基、5-C-甲基、反向脱氧无碱基残基并入和锁定核酸。10.如权利要求9所述的化合物，其中所述修饰分别位于所述saRNA或所述ASO的末端核苷碱基处。11.如权利要求9所述的化合物，其中所述修饰不分别位于所述saRNA或所述ASO的末端核苷碱基处。12.如权利要求9所述的化合物，其中所述修饰保护免受血清源性核酸酶。13.一种药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂和如权利要求1所述的化合物。14.如权利要求13所述的药物组合物，其还包含第二治疗剂。15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自由以下组成的组：抗肿瘤剂或抗癌剂、细胞毒性剂、细胞抑制剂、消炎剂、止痛剂、抗感染剂、生长抑制剂、免疫原性剂、免疫调节剂和趋化因子。16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述抗癌剂是细胞死亡促进剂。17.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自由以下组成的组：放线菌素D/更生霉素、博莱霉素、柔红霉素、多柔比星、多柔比星(聚乙二醇化脂质体)、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、依托泊苷、多西他赛、伊立替康、太平洋紫杉醇、拓扑替康、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、顺铂、奥沙利铂、阿仑单抗、BCG、贝伐单抗、西妥昔单抗、地诺单抗、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、干扰素、伊匹单抗、拉帕替尼、单甲基澳瑞他汀E(MMEA)、莫坦辛(DM1)、利妥昔单抗、舒尼替尼、索拉非尼、坦罗莫司和曲妥珠单抗或其任何组合。18.一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1所述的化合物。19.如权利要求18所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、头颈部癌、食道癌、皮肤癌、黑素瘤、脑癌、结肠直肠癌、白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。20.如权利要求18所述的方法，其中治疗所述受试者的所述癌症，同时刺激免疫应答。21.如权利要求20所述的方法，其中所述化合物包含：(i)CEBPA、p21或p53的saRNA缀合于具有SEQIDNO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者，或(ii)具有SEQIDNO:31-42和110-113的STATASO缀合于具有SEQIDNO:7-18和98-101的硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ODN)中的一者。22.如权利要求18所述的方法，其中治疗所述受试者的所述癌症，而不同时刺激免疫应答。23.如权利要求22所述的方法，其中所述化合物包含CEBP...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·T·科尔蒂莱夫斯基，P·M·希维德尔斯基，D·F·莫雷拉，
申请(专利权)人：希望之城，
类型：发明
国别省市：美国,US